方權(quán)輝， 林友文

瓜環(huán)(cucurbit[n]uril, Q[n],n=5～10)又稱葫蘆脲，具有大小不同的疏水空腔及多個(gè)羰基端口，是一類新型的大環(huán)主體超分子藥物載體[1-2]。瓜環(huán)的穩(wěn)定性及安全性均良好，被廣泛應(yīng)用于藥物的包合及緩控釋領(lǐng)域[3-4]。瓜環(huán)根據(jù)其空腔大小可選擇性包合某些藥物分子，形成主-客體超分子包合物，以達(dá)到延長半衰期、改善藥物理化性質(zhì)、提高藥物生物利用度以及降低不良反應(yīng)等目的[5-8]。

鹽酸地爾硫卓(diltiazem hydrochloride，DIL)為鈣通道阻滯藥，可以有效緩解心絞痛，并降低血壓。但因其半衰期為3.5 h，生物利用度僅為40%，且常見惡心、浮腫、頭痛、皮疹等不良反應(yīng)，限制了其在臨床上的應(yīng)用[9-11]。因此，將DIL制成緩釋制劑有望減少服藥次數(shù)和血藥濃度波動(dòng)，改善其生物利用度，降低藥物的不良反應(yīng)。本研究通過光譜學(xué)方法研究Q[7]及Q[8]與DIL的主-客體包合作用，考察包合物在不同介質(zhì)中的體外釋藥性能，對(duì)研發(fā)以瓜環(huán)為載體的pH敏感性藥物緩釋劑及應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑 DIL(純度99.5%)(百靈威科技有限公司)，瓜環(huán)Q[7]和Q[8](瑞士Fluka試劑公司)，核磁共振儀(AVANCE Ⅲ，瑞士Bruker BioSpin公司)，熒光光度計(jì)(Cary Eclipse，美國安捷倫公司)，紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2600，日本島津公司)，高精密透析袋(MWCO:500-1000，美國光譜醫(yī)藥公司)，恒溫振蕩器(SHA-B，常州國華儀器有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1紫外光譜及熒光光譜的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[12]的方法，分別配制1.0×10-4mol/L的Q[7]和Q[8]溶液以及4.0×10-4mol/L的DIL溶液。采用摩爾比法(即固定客體DIL濃度)以及Job法(即等物質(zhì)的量連續(xù)變化法)，進(jìn)行測(cè)定。

1.2.21H NMR譜的測(cè)定 在25 ℃下，D2O為溶劑，稀DCl調(diào)節(jié)pH=2，在核磁共振儀上測(cè)定1H NMR譜。

1.2.3制備主-客體包合物 參照文獻(xiàn)[13]的方法，按n(Q[n])/n(DIL)=1∶1將Q[n]和DIL分別溶于雙蒸水中(超聲10 min)，室溫?cái)嚢? h，蒸去溶劑、真空干燥，分別制得Q[7]-DIL及Q[8]-DIL包合物。

1.2.4Q[7]-DIL及Q[8]-DIL的包合比和包合平衡常數(shù)(Ka)測(cè)定 采用摩爾比法測(cè)定體系的包合比，以236 nm處的吸光度對(duì)n(Q[n])/n(DIL)作變化趨勢(shì)圖，并用Job法進(jìn)行驗(yàn)證。主-客體的Ka參照文獻(xiàn)[14]通過下列公式計(jì)算：

式中，m表示包合比，[Q]i為瓜環(huán)的濃度，ΔA為加入瓜環(huán)前后DIL的吸光度變化值，[DIL]是DIL的濃度，Ka為包合穩(wěn)定常數(shù)，Δε為包合前后DIL的摩爾吸光系數(shù)變化值。

1.2.5DIL原藥及主-客體包合物的體外累積釋放度的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]的恒溫振蕩法，準(zhǔn)確稱取5.00 mg的DIL、17.9 mg的Q[7]-DIL包合物及19.7 mg的Q[8]-DIL包合物，分別置于透析袋內(nèi)，

A：Q[7]-DIL體系；B：Q[8]-DIL體系. a～i: (NQ[n]/NDIL=0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0).圖1 瓜環(huán)-DIL包合作用的紫外圖譜Fig 1 UV spectra of Q[n]-DIL inclusion system

A：Q[7]-DIL體系；B：Q[8]-DIL體系. a～i: (NQ[n]/NDIL=0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0).圖2 瓜環(huán)-DIL作用體系的熒光圖譜Fig 2 Fluorescent emission spectra of Q[n]-DIL

A：Q[7]-DIL體系；B：Q[8]-DIL體系. 插圖：ΔA～n(Q[n])/[n(Q[n])+n(DIL)]變化曲線.圖3 Q[7]-DIL和Q[8]-DIL作用體系的吸光度對(duì)n(Q[n])/n(DIL)變化曲線圖Fig 3 Absorbance～n(Q[n])/n(DIL) curve of Q[7]-DIL and Q[8]-DIL

并放在20 mL鹽酸液(pH=1.2)、磷酸鹽緩沖液(pH=4.0)或磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)中，控制釋放液溫度為(37±0.5)℃，在恒溫振蕩器中振蕩(100 r/min)，分別于10，20，30，45，70，100，130，180，280，400 min等時(shí)間點(diǎn)各取樣1 mL(并補(bǔ)充同體積介質(zhì))，稀釋25倍，于236 nm波長處分別測(cè)定吸光度(取3份平行試驗(yàn)的平均值)，根據(jù)線性范圍為c=5～25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算得藥物的濃度及累積釋放度，繪制藥物累積釋放曲線。

2 結(jié) 果

2.1Q[7]及Q[8]與DIL相互作

用的紫外光譜 隨Q[7]及Q[8]濃度的增大，Q[7]-DIL及Q[8]-DIL體系的吸收強(qiáng)度均逐漸降低，在236 nm處的最大吸收峰處均出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象，并存在多個(gè)等吸收點(diǎn)(圖1)。

2.2Q[7]及Q[8]與DIL相互作用的熒光光譜 Q[7]及Q[8]與DIL發(fā)生超分子包合作用時(shí)，熒光光譜的最大發(fā)射波長(λem)和激發(fā)波長(λex)分別為270和260 nm，DIL和瓜環(huán)在上述波長范圍內(nèi)均不發(fā)射熒光。圖2顯示DIL的熒光強(qiáng)度隨著Q[7]和Q[8]的濃度增大均顯著增強(qiáng)。

2.3Q[7]-DIL及Q[8]-DIL的包合比和Ka 以236 nm處的吸光度值對(duì)n(Q[n])/n(DIL)作變化趨勢(shì)圖(圖3)，均在主-客體物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)。用Job法進(jìn)行驗(yàn)證，即圖3中的插圖部分顯示，兩個(gè)體系的紫外吸收變化的最大值都對(duì)應(yīng)于體系n(Q[n])/[n(Q[n])+n(DIL)]=0.5處。兩種方法均表明Q[7]-DIL和Q[8]-DIL體系的包合比均為1∶1，計(jì)算得兩種體系的Ka分別為6.28×103和8.69×103L/mol(線性相關(guān)系數(shù)r分別為0.997和0.995)。

2.4Q[7]及Q[8]與DIL相互作用的1H NMR譜 圖4中A，B，C分別為客體DIL、n(Q[7])/n(DIL)為1∶1時(shí)、n(Q[8])/n(DIL)為1∶1時(shí)的1H NMR譜圖，通過比較圖4B和圖4A，DIL結(jié)構(gòu)中的H9，H10，H11，H12和H13質(zhì)子峰化學(xué)位移由原來的δ 5.12，δ 4.05，δ 7.34，δ 6.96和δ 3.78分別移向高場(chǎng)δ 4.92，δ 2.68，δ 6.50，δ 6.06和δ 1.30，DIL其余位置上質(zhì)子峰的化學(xué)位移沒有改變，表明Q[7]的空腔包合了DIL的甲氧苯基結(jié)構(gòu)部分。比較圖4A和圖4C，DIL結(jié)構(gòu)中的H9，H10，H11，H12和H13質(zhì)子峰化學(xué)位移由原來的δ 5.12，δ 4.05，δ 7.34，δ 6.96和δ 3.78分別移向高場(chǎng)δ 4.90，δ 2.48，δ 6.27，δ 5.82和δ 1.30，DIL其余位置上質(zhì)子峰的化學(xué)位移未發(fā)生位移，表明DIL的甲氧苯基結(jié)構(gòu)單元進(jìn)入瓜環(huán)，與Q[8]發(fā)生包合作用，推測(cè)Q[7]及Q[8]與DIL可能的包合作用模式如圖5所示。

A：DIL體系；B：Q[7]-DIL體系；C：Q[8]-DIL體系.圖4 DIL，Q[7]-DIL及Q[8]-DIL體系的1H NMR譜圖Fig 4 1H NMR spectra of DIL, Q[7]-DIL and Q[8]-DIL system

圖5 Q[7]-DIL及Q[8]-DIL可能的包合作用模式Fig 5 Possible mode of interaction between DIL and Q[n](n=7, 8)

2.5DIL及其包合物的體外釋藥性能 DIL原藥及其包合物Q[7]-DIL和Q[8]-DIL在pH為1.2，4.0和6.8的介質(zhì)中的體外藥物累積釋放曲線見圖6。DIL原藥在3種溶出介質(zhì)的400 min累積藥物釋放度分別為98.51%，97.76%及97.80%；Q[7]-DIL分別為44.80%，56.16%及68.05%；Q[8]-DIL分別為39.28%，52.70%及58.34%。表明Q[7]-DIL及Q[8]-DIL在pH為1.2介質(zhì)中的緩釋效果最明顯，在pH為4.0和6.8的介質(zhì)中也有一定的緩釋作用。

3 討 論

光譜分析法是研究超分子包合作用的常用方法[14]，DIL在波長236 nm處有強(qiáng)的紫外吸收(而瓜環(huán)在波長>210 nm沒有紫外吸收)，加入Q[7]或Q[8]后，包合DIL結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)單元，從而使苯環(huán)結(jié)構(gòu)單元E2紫外吸收譜帶受到影響，吸收峰位移并且吸收強(qiáng)度不斷降低，UV-Vis吸收光譜圖中出現(xiàn)多個(gè)等吸收點(diǎn)，表明Q[7]和Q[8]均對(duì)DIL有超分子包合作用。

A：pH=1.2；B：pH=4.0；C：pH=6.8.圖6 DIL，Q[7]-DIL及Q[8]-DIL在不同pH介質(zhì)中的體外累積釋放度Fig 6 The cumulative dissolution rate of DIL, Q[7]-DIL and Q[8]-DIL in different pH buffers

隨著主體瓜環(huán)濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的增強(qiáng)，這可能是由于瓜環(huán)的疏水性空腔為非極性環(huán)境，具有熒光的客體DIL部分結(jié)構(gòu)單元進(jìn)入瓜環(huán)疏水空腔后，客體分子的水分子的松弛效應(yīng)和運(yùn)動(dòng)自由度顯著降低，從而阻止碰撞失活、降低了非輻射躍遷概率；同時(shí)DIL進(jìn)入瓜環(huán)的空腔后，其熒光單重態(tài)受到屏蔽，減少了和碎滅劑接觸。兩個(gè)原因均使得客體DIL的熒光量子產(chǎn)率增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[16]，也表明Q[7]和Q[8]對(duì)DIL產(chǎn)生超分子包合作用。

對(duì)客體DIL與包合物Q[7]-DIL及Q[8]-DIL的1H NMR譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)DIL的甲氧苯基結(jié)構(gòu)部分質(zhì)子峰化學(xué)位移向高場(chǎng)位移明顯，DIL其余位置上質(zhì)子峰的化學(xué)位移沒有改變，均說明Q[7]及Q[8]與DIL的甲氧苯基結(jié)構(gòu)單元發(fā)生包合作用。摩爾比法測(cè)定體系的包合比，并應(yīng)用Job法進(jìn)行驗(yàn)證，Q[7]-DIL及Q[8]-DIL體系的包合比均為1∶1，Ka分別為6.28×103和8.69×103L/mol。結(jié)合熒光光譜、紫外光譜、1H NMR譜和主-客體作用包合比，提出了可能的Q[7]及Q[8]與DIL包合作用模式。

由體外藥物累積釋放結(jié)果顯示，DIL原藥在3種溶出介質(zhì)中均快速釋放，這是由于DIL的水溶性較好所致。包合物Q[7]-DIL及Q[8]-DIL在pH為1.2的介質(zhì)中的緩釋效果最明顯，400 min藥物累積釋放度分別為44.80%和39.28%；其次是在pH為4.0的介質(zhì)中均有緩慢釋放，其400 min藥物累積釋放度分別為56.16%和52.70%；在pH為6.8的介質(zhì)中的緩釋效果最小，分別為68.05%和58.34%。介質(zhì)的酸性越強(qiáng)，400 min體外藥物累積釋放度越小，緩釋越明顯，顯示藥物緩釋作用具有明顯的pH敏感性?？疾觳煌琾H介質(zhì)中對(duì)Q[7]-DIL和Q[8]-DIL體系包合作用的影響，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)瓜環(huán)與DIL的主-客體包合作用具有pH敏感性，這與包合物的pH敏感性藥物緩釋一致。由于在強(qiáng)酸性的條件下，DIL分子中甲氧苯基的含氧結(jié)構(gòu)單元(甲氧基)的氧原子具有孤電子對(duì)，易與氫質(zhì)子結(jié)合發(fā)生質(zhì)子化形成帶電陽離子，瓜環(huán)端口的羰基氧可以與質(zhì)子化后的DIL陽離子結(jié)構(gòu)單元之間產(chǎn)生較強(qiáng)的離子-偶極作用，產(chǎn)生較牢固的超分子包合作用，藥物分子DIL不易從主體空腔脫離釋放，從而減慢了釋藥速度。結(jié)果表明七元、八元瓜環(huán)對(duì)DIL產(chǎn)生1∶1的超分子包合作用，包合后對(duì)藥物DIL具有明顯的pH敏感性緩釋效果，有望應(yīng)用于研發(fā)pH調(diào)控的超分子瓜環(huán)-藥物緩控釋系統(tǒng)。