王 斐，何偉亮，謝 璐，曾招林，陳水親，宋 濤，劉志平

(贛南醫(yī)學(xué)院1.2017級(jí)碩士研究生；2.2016級(jí)生物技術(shù)本科生；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's Diseases, CD)，是一種慢性反復(fù)發(fā)作的炎癥性腸道疾病，表現(xiàn)為腹瀉、腹痛和便血等癥狀,其病變主要累及回腸和結(jié)直腸。IBD病情反復(fù)發(fā)作,遷延不愈，嚴(yán)重影響患者正常的生活質(zhì)量[1-2]。IBD 的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,至今仍未被完全闡明,主要可能與遺傳的缺陷、免疫功能的紊亂以及腸道菌群的失調(diào)等有關(guān)[2-4]。因此，干預(yù)上述環(huán)節(jié)，可能延緩或減弱炎癥反應(yīng)過(guò)程。5-氨基水楊酸類化合物、皮質(zhì)類固醇類激素、多種免疫抑制劑和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑等為臨床常用治療IBD的藥物[5]。然而，這些藥物存在療效有限且不良反應(yīng)多,甚至有致癌作用[6-7]。因此, 尋找一種新型有效且不良反應(yīng)小的藥物成為當(dāng)務(wù)之急。

油茶是山茶科山茶屬植物,是中國(guó)南方的特色樹(shù)種[8-9]。油茶樹(shù)產(chǎn)出的果稱為油茶籽,其提煉的油即是茶油。茶油是一種綠色、原生態(tài)、高營(yíng)養(yǎng)的物質(zhì)，是廣為認(rèn)可的保健食用油,有“東方橄欖油”之稱[10]。近年研究顯示油茶中含有抗腫瘤、抗氧化、殺菌和抗炎癥作用的多種特殊成分[11-14]。茶枯餅為油茶果實(shí)榨取茶油后的殘?jiān)? 在中藥大辭典和嶺南草藥志中記載茶枯餅含有多種藥用成分[15]，但具體作用尚不清楚。本研究對(duì)茶枯餅進(jìn)行處理后，獲得茶枯餅提取物(Camellia cake extracts, CCEs)，以細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的C57 BL/6小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophages,BMDM)為研究對(duì)象，探究CCEs對(duì)LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1小鼠的來(lái)源C57 BL/6小鼠從南京模式動(dòng)物研究所購(gòu)買(mǎi)(N000013)，之后飼養(yǎng)在贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1茶枯餅提取物的提取和純化CCEs的提取和純化根據(jù)文獻(xiàn)描述的方法[16-17]。取油茶籽粕(油茶籽榨取完油后的茶餅),碎粉,過(guò)60目篩,加入6倍量的濃度為75%的乙醇溶液回流提取2.5 h。剩余殘?jiān)尤?倍量的濃度為75%的乙醇溶液回流提取2 h。然后合并乙醇提取液。將提取液濃縮到原體積的1/5,逐步加入丙酮至不再產(chǎn)生明顯沉淀(約為2倍量),放置過(guò)夜。濾取沉淀,在50 ℃下,邊振邊搖加入70%甲醇至剛好溶解,過(guò)濾,濾液置于5 ℃左右的環(huán)境中靜置8 h以上,濾取結(jié)晶,得CCEs粗品。取CCEs粗品,過(guò)D-101型大孔樹(shù)脂,10%、30%、50%、70%的乙醇溶液洗脫,TCL檢識(shí),得CCEs精制品。

1.2.2BMDM的培養(yǎng)根據(jù)文獻(xiàn)的方法[18], 取得骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)在有L-細(xì)胞液體的IMDM加入10% FBS、1%的非必需氨基酸和1%的盤(pán)尼西林-鏈霉素, 培養(yǎng)5 d制備BMDM。我們將使用0、30和50 μg·mL-1SQS處理BMDM 12 h，然后用LPS刺激，在0、10、30、60和120 min后收集細(xì)胞，用Western-blot測(cè)定NF-κB的激活水平。在0、1、4和8 h后收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平。

1.2.3PCR測(cè)定目標(biāo)基因表達(dá)在特定時(shí)間收集樣品，使用Trizol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 然后通過(guò)目標(biāo)基因如細(xì)胞因子的特定引物使用Sybergreen試劑盒檢測(cè)基因表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1LPS刺激BMDM的合適時(shí)間點(diǎn)測(cè)定為了研究CCEs能否抑制NF-κB信號(hào)通路和促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，我們按照文獻(xiàn)方法[19-20]利用LPS刺激下的BMDM來(lái)研究。我們探究了LPS刺激BMDM細(xì)胞的最適時(shí)間與CCEs能夠影響LPS刺激的BMDM細(xì)胞的最適濃度。我們首先采用1 μg·mL-1的LPS分別刺激BMDM細(xì)胞1、2、 4、8和16 h，細(xì)胞數(shù)量為1×106每組，Control組未受LPS刺激。收細(xì)胞后用PCR測(cè)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、角質(zhì)細(xì)胞趨化因子(KC)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子IL-6, TNF-α均在LPS刺激4 h時(shí)存在炎癥因子峰值，并且抗氧化指標(biāo)因子iNOS在8 h后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。各炎癥細(xì)胞因子峰值均出現(xiàn)在LPS刺激4 h或4 h之前，故本次實(shí)驗(yàn)選用4 h之前為L(zhǎng)PS刺激BMDM的合適時(shí)間點(diǎn)(圖1)。

2.2LPS刺激BMDM的合適CCEs濃度測(cè)定首先，將CCEs分別稀釋為0.625、1.25、2.5、 5、10、20和40 μg·mL-1，分別刺激1×106BMDM 12 h，之后再用濃度為1 μg·mL-1的LPS刺激4 h，其中Control組為未加CCEs與LPS，LPS組為未加CCEs只加LPS，收細(xì)胞后用PCR測(cè)IL-6和 TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，當(dāng)CCEs濃度大約在0.6～1 μg·mL-1左右時(shí)，IL-6、TNF-α細(xì)胞因子表達(dá)水平較單純LPS刺激有低的趨勢(shì)，但在高濃度時(shí)候，細(xì)胞因子表達(dá)均處在上升階段，這也可能與細(xì)胞過(guò)量刺激有關(guān)，因此我們選取CCEs濃度為0.625～2.5 μg·mL-1為刺激BMDM的合適濃度(圖2)。

2.3CCEs對(duì)LPS刺激的BMDM細(xì)胞因子表達(dá)的影響當(dāng)選定出了LPS的最佳刺激時(shí)間與CCEs最佳刺激濃度后，為了更加系統(tǒng)全面的研究CCE對(duì)于促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，我們將CCEs濃度分為3組，其中0.5 μg·mL-1為低濃度組(CCEs-L)，1 μg·mL-1為中濃度組(CCEs-M)，2 μg·mL-1為高濃度組(CCEs-H)。之后，我們將3組CCEs濃度分別刺激細(xì)胞數(shù)為1×106的BMDM細(xì)胞12 h之后， 再用1 μg·mL-1LPS刺激4 h，使用PCR測(cè)定各類經(jīng)典炎癥細(xì)胞因子，其中未加CCEs與LPS刺激設(shè)為對(duì)照組，單純LPS刺激4 h設(shè)為L(zhǎng)PS組。收細(xì)胞后用PCR測(cè)相關(guān)經(jīng)典炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、KC和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達(dá)水平。經(jīng)綜合對(duì)照后發(fā)現(xiàn)，3組CCEs濃度刺激中，IL-6、TNF-α、KC、MCP-1炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平與LPS組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，也未出現(xiàn)劑量效應(yīng)。這些研究結(jié)果表明，CCEs在LPS刺激后的BMDM細(xì)胞中沒(méi)有明顯的抑制炎癥效果(圖3、表1)。

所有LPS刺激組均與Control組比較， ***P<0.001；****P<0.0001。

所有LPS+CCEs刺激組均與Control組比較，*P<0.05；***P<0.001；****P<0.0001。

圖3 CCEs對(duì)LPS刺激的BMDM細(xì)胞因子表達(dá)的影響

組別IL-6TNF-αKCMCP-1Control0.00004±0.00001?0.00458±0.00005??0.00006±0.00000?0.04160±0.00283?LPS0.05508±0.061520.53990±0.011840.05618±0.028450.70740±0.15940LPS+CCEs-L0.08681±0.10490#0.58170±0.22780#0.05414±0.00692#0.81950±0.25590#LPS+CCEs-M0.04192±0.04164#0.47780±0.06635#0.04834±0.03528#0.61320±0.09711#LPS+CCEs-H0.06648±0.07233#0.59100±0.09551#0.06552±0.03937#1.06600±0.13400#F0.484409.297001.82112.19

注：與LPS組比較，*P<0.05；**P<0.01；#表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

研究表明，許多植物中茶多酚和茶皂素能夠抑制NF-κB信號(hào)通路和相關(guān)促炎癥細(xì)胞因子來(lái)抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展。油茶三萜醇等油茶果提取物能夠抑制十四酰佛波乙酯所誘導(dǎo)的小鼠耳炎[21]；油茶根提取物能夠通過(guò)環(huán)氧酶與脂肪氧合酶通路抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的大鼠的爪部水腫[22]。在我們的研究中，通過(guò)參考文獻(xiàn)，先用最適濃度的油茶餅提取物與BMDM細(xì)胞共培養(yǎng)，然后用LPS刺激，CCEs并沒(méi)有產(chǎn)生預(yù)想的抑制炎癥效果，各濃度組CCEs與LPS組在炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平上并未出現(xiàn)明顯差別，因此推測(cè)CCEs在LPS刺激的BMDM細(xì)胞中并未產(chǎn)生相應(yīng)抑炎影響。我們分析出現(xiàn)這種情況的可能原因是因?yàn)槲覀儽敬蜟CEs采用油茶中榨油殘?jiān)杩蒿炈?，而文獻(xiàn)中多采用植物的籽、莖、根、果等提取，可能后者提取物抗炎成分相對(duì)較充足。另外，我們本次實(shí)驗(yàn)采用75%乙醇溶劑提取CCEs，而在其它文獻(xiàn)中提取方法各異，而在兩次實(shí)驗(yàn)中[21-22]均采用甲醇溶劑提取油茶果或根所得提取物。提取部位、溶劑和提取時(shí)間的不同都能影響提取物成分的不同。可是，就我們目前的研究條件下，75%乙醇所提取的茶枯餅提取物并不能在LPS刺激的BMDM細(xì)胞中產(chǎn)生抑制炎癥的作用。