夏 飛， 上官曉雨， 馮思亮， 汪夢(mèng)雯， 楊 苗， 胡 松， 鄭 雪

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

烏頭(AconitumcarmichaeliDebx.)為毛茛科，烏頭屬多年生草本藥用植物，其子根經(jīng)炮制、加工后形成我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)上常用的一種中藥材——附子.傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為附子味甘、大熱、有大毒，是公認(rèn)的補(bǔ)火要藥[1]，具有抗炎、提高機(jī)體免疫力、麻醉止痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效.在臨床上，附子對(duì)于慢性腎炎、急性菌痢疾等疾病，具有良好的治療效果[2].由于附子良好的臨床藥用效果，對(duì)附子生物資源的綜合開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義.

植物內(nèi)生真菌是共生于植物組織中而不引起植物病變的真菌[3]，內(nèi)生真菌能刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育并能提高植物抗逆能力[4]，往往具有豐富的物種多樣性[5,6].目前認(rèn)為，植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與植物相同或者相似的化學(xué)成分.藥用植物中的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生萜類、生物堿類、苯丙素類、甾體化合物等多種次生代謝物[7,8]，在生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)、農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防治等各方面極具開(kāi)發(fā)價(jià)值.其次，內(nèi)生真菌還能夠產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)，由于其物質(zhì)來(lái)源的天然性，具有較高安全性，可作為食品中抑制微生物的添加劑[3].大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌是食品中常見(jiàn)的污染菌[9-11]，能夠引起食品腐敗變質(zhì)，甚至危害人體健康.因此，從藥用植物中分離、篩選真菌資源抑制這些有害微生物就顯得尤為重要.

目前，烏頭內(nèi)生真菌微生物資源開(kāi)發(fā)利用仍不夠充分.為深入開(kāi)發(fā)利用烏頭內(nèi)生真菌資源，本研究從烏頭側(cè)根中分離若干內(nèi)生真菌菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS序列分析對(duì)其進(jìn)行初步的分類鑒定.并探索分離菌株發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌(EsherichiacoliCMCC (B) 44102)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC (B) 26003)、四聯(lián)球菌(Micrococcustetragenus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的抑菌活性.并從生長(zhǎng)曲線、胞外蛋白含量及電導(dǎo)率變化方面，初步探究其抑菌機(jī)制.本研究為通過(guò)微生物工程、發(fā)酵工程手段綜合開(kāi)發(fā)利用烏頭藥用植物資源奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料及菌種

新鮮烏頭側(cè)根，來(lái)源于漢中，南鄭區(qū)附子栽培基地.

供試菌株：大腸桿菌(EsherichiacoliCMCC (B) 44102)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC (B) 26003)、四聯(lián)球菌(Micrococcustetragenus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)均為本研究室保藏菌株.

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

葡萄糖、氯化鈉、瓊脂粉、酵母浸粉、蛋白胨，以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.真菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司).

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然.PDA中不添加瓊脂即為PDB培養(yǎng)基.

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，pH為7.0.

1.1.3 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(SP-756PC，上海光譜儀器有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(LS-C50L，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠)；離心機(jī)(TDL-80-2B，上海安亭科學(xué)儀器廠)；霉菌培養(yǎng)箱(MJX-150-Ⅱ,北京科偉永興儀器有限公司)；電導(dǎo)率儀(DDSJ-308A，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離

將新鮮烏頭側(cè)根清洗干凈，用無(wú)菌水清洗三次.在超凈工作臺(tái)中用75%(v/v)的酒精清洗其表面，再用無(wú)菌水淋洗烏頭表面殘余酒精.切取清洗干凈的烏頭側(cè)根表面材料，置于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，以確定烏頭側(cè)根表面無(wú)微生物污染.按照張立新等[12]的方法采用PDA培養(yǎng)基對(duì)烏頭側(cè)根中內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，分離出真菌菌株純化后保存?zhèn)溆?

1.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

(1)平板形態(tài)觀察

將分離出的真菌單點(diǎn)接種于PDA平板，在28 ℃下培養(yǎng)7 d.觀察分離菌株的菌落和顯微細(xì)胞形態(tài).

(2)轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列分析

無(wú)菌條件下刮取單菌落菌絲至研缽，加入無(wú)菌石英砂，研磨.并使用試劑盒提取菌株DNA.之后采用引物對(duì)ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)真菌的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增[13].PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件如前所述[14].PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)大小及完整性后，送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析.測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并采用MEGA 6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，選用Neighbor-Joining繪圖算法，重復(fù)迭代1 000次[15].

1.2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌活性及機(jī)制探究

(1)抑菌效果研究

內(nèi)生真菌發(fā)酵液抑菌作用采用濾紙片法[16]進(jìn)行測(cè)定.將無(wú)菌濾紙片浸滿過(guò)濾除菌后的內(nèi)生菌發(fā)酵液，用無(wú)菌鑷子置于涂滿指示菌的平板上.指示菌為細(xì)菌的平板置于37 ℃下培養(yǎng)24 h；酵母指示菌平板置于28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈直徑.選擇抑菌效果最明顯的內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行抑菌機(jī)制的研究.

(2)抑菌機(jī)制研究

探討不同添加量的菌株C的除菌發(fā)酵液對(duì)指示菌生長(zhǎng)的影響.每100 mL指示菌發(fā)酵液中分別添加0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL菌株C的除菌發(fā)酵液，置于37 ℃，130 rpm/min條件下培養(yǎng).每2 h取樣，于600 nm處測(cè)得吸光值，測(cè)定指示菌的生長(zhǎng)曲線[17].為研究菌株C的除菌發(fā)酵液對(duì)指示菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定指示菌液蛋白質(zhì)含量[18]，指示菌電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀進(jìn)行測(cè)定.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果表示為Means±SD，采用ORIGIN(Origin Pro 9.0)作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 烏頭側(cè)根內(nèi)生真菌的分離及菌落形態(tài)

從烏頭側(cè)根中分離的若干菌株中，其中4株在PDA培養(yǎng)基上形態(tài)差別非常明顯(如圖1所示)，分別命名為菌株A，菌株B，菌株C和菌株D.菌株A菌落呈現(xiàn)青竹色(#72baa7)，菌落表面有放射狀皺紋，并有紅色滲出液滴分布于菌落之上(圖1(a))，并滲入培養(yǎng)基中，平板背面呈現(xiàn)紫紅色.菌株B的菌落呈現(xiàn)灰色，菌落表面呈現(xiàn)褶皺(圖1(b))，菌株B產(chǎn)生黃色色素滲入培養(yǎng)基中呈現(xiàn)亮黃色.菌株C菌落呈現(xiàn)松葉色(#74905d)細(xì)密的形態(tài)，在平板表面如同粉末狀，無(wú)褶皺.菌落周?chē)z呈現(xiàn)白色，無(wú)液滴滲出及色素產(chǎn)生現(xiàn)象(圖1(c)).菌株D菌落呈現(xiàn)草色(#6d8346)，質(zhì)地細(xì)密，菌落上有褶皺，無(wú)色素產(chǎn)生(圖1(d)).

(a)菌株A (b)菌株B

(c)菌株C (d)菌株D圖1 內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)

2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

2.2.1 內(nèi)生真菌ITS序列分析

將4株真菌的ITS序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖2所示.結(jié)果表明:菌株A與Talaromyces屬聚在一簇，具有極高的相似性，初步確定菌株A是籃狀菌屬(Talaromyces)真菌.菌株B與青霉屬(Penicillium)的真菌在同一簇，具有非常高的同源性.菌株C與Aspergillus屬Aspergillusniger、A.tubingensis、A.costaricaensis等具有很高同源性，初步確定菌株C為曲霉屬(Aspergillus)真菌.菌株D與枝孢霉屬(Cladosporium)真菌同源性較高，可初步判斷菌株D是枝孢霉屬(Cladosporium)真菌.本研究中分離到的四株內(nèi)生真菌的分類信息初步確定為T(mén)alaromyces、Penicillium、Aspergillus和Cladosporium四個(gè)屬.這四種內(nèi)生真菌,李治瀅等[19]從藥用烏頭中也曾分離到.由于ITS序列用于真菌分類的分辨率并不是特別精確，僅依據(jù)ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并不能對(duì)分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)行準(zhǔn)確分類，需結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察等方法做進(jìn)一步探討.

圖2 分離的內(nèi)生真菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2.2 內(nèi)生真菌的顯微形態(tài)觀察

菌株A的子囊果由菌絲交織而成，無(wú)孔口，狀若籃網(wǎng)，外無(wú)硬殼包裹(圖3(a))，其子囊的形態(tài)與文獻(xiàn)[20,21]中報(bào)道的籃狀菌屬相似.菌株A分生孢子頭呈現(xiàn)帚狀分枝，未見(jiàn)其有足細(xì)胞(圖3(b)).其子囊孢子呈現(xiàn)橢圓形(圖3(c))，單生.結(jié)合ITS序列分析及形態(tài)學(xué)的觀察，菌株A與籃狀菌屬中T.purpureogenus極為相似.T.purpureogenus曾被報(bào)道從三七中分離得到，其能夠產(chǎn)生2個(gè)Drimane倍半萜化合物[22].菌株B形成子囊果進(jìn)行有性生殖，其子囊果是由菌絲纏繞而使其呈現(xiàn)球型，外部無(wú)閉囊殼，子囊表面不光滑(圖3(d)).菌株B分生孢子頭呈現(xiàn)掃帚狀，分生孢子較大，呈現(xiàn)圓形(圖3(e)、(f))結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析及顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)，菌株B與橘青霉(P.citrinum)的特征極為相似.

菌株C的子囊果為規(guī)則的圓形，其中包含大量的孢子(圖3(g))；其分生孢子頭形態(tài)呈掃把狀，無(wú)足細(xì)胞(圖3(h))；菌株C的孢子呈串排列(圖3(i)).通過(guò)ITS序列比對(duì)，菌株C與黑曲霉的相似度達(dá)到100%，但通過(guò)平板形態(tài)觀察與顯微形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)菌株C與常見(jiàn)的黑曲霉(A.niger)的形態(tài)并不一致.導(dǎo)致這一結(jié)果的原因是由于黑曲霉類群包含8種在形態(tài)上難以區(qū)分的分類群，A.tubingensis、A.luchuensis和A.costaricaensis都包含于A.niger中[23].菌株D的子囊果呈現(xiàn)較松散球型，無(wú)外殼包裹.子囊果外圍由子囊致密地排列，而中間的子囊較為松散(圖3(j)).其分生孢子呈分枝狀，分生孢子梗略作匍匐狀(圖3(k))，分生孢子形成短鏈(圖3(l)).菌株D與Cladsporiumcladosporioides形態(tài)最為接近，據(jù)報(bào)道，Cladsporiumcladosporioides是一種能夠產(chǎn)生紫杉醇的真菌[24,25].

(a)菌株A子囊果形態(tài)(×100) (b)菌株A分生孢子頭形態(tài)(×100) (c)菌株A孢子形態(tài)(×400) (d)菌株B子囊果形態(tài)(×100) (e)菌株B分生孢子頭形態(tài)(×100) (f)菌株B分生孢子頭及孢子形態(tài)(×400) (g)菌株C子囊果形態(tài)(×100) (h)菌株C分生孢子頭形態(tài)(×100) (i)菌株C孢子形態(tài)(×400) (j)菌株D子囊果形態(tài)(×100) (k)菌株D分生孢子頭形態(tài)(×100) (l)菌株D孢子形態(tài)(×400)圖3 烏頭側(cè)根內(nèi)生真菌的顯微鏡形態(tài)

2.3 內(nèi)生真菌的抑菌活性

2.3.1 具有抑菌活性的內(nèi)生真菌的篩選

內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌活性如表1所示.菌株C的除菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，對(duì)四聯(lián)球菌也有一定的抑制作用(圖4)，然而菌株C除菌發(fā)酵液對(duì)其他指示菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及釀酒酵母并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯抑制作用.本研究中分離的其它內(nèi)生真菌對(duì)指示菌的抑制效果并不明顯.

表1 內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌作用

注：“-”表示無(wú)抑制作用，“+”表示有抑制作用，“++”表示抑制作用較明顯

(a)金黃色葡萄球菌 (b)四聯(lián)球菌圖4 菌株C發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌的抑制效果

2.3.2 菌株C發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

添加不同量的菌株C的除菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出抑制作用(圖5).菌株C發(fā)酵液在金黃色葡萄球菌發(fā)酵液中比例小于0.4%時(shí)，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)與對(duì)照組相同，在0～4 h處于生長(zhǎng)遲滯期，4～12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期.添加了菌株C發(fā)酵液的實(shí)驗(yàn)組中金黃色葡萄球菌仍然能夠生長(zhǎng)，但相同時(shí)期其菌量明顯低于對(duì)照組.當(dāng)發(fā)酵液添加量大于0.4%時(shí)，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)受到極大的抑制，在4～12 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期未進(jìn)行增殖.當(dāng)培養(yǎng)至12 h時(shí)，金黃色葡萄球菌開(kāi)始進(jìn)行增殖.由此可以推斷，菌株C的除菌發(fā)酵液可以推遲金黃色葡萄球菌的對(duì)數(shù)期.蔣斌等[26]在研究連翹對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)制時(shí)，也發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的菌量值低于對(duì)照組，連翹可推遲其對(duì)數(shù)期，在一定程度上與本研究結(jié)果相近.

圖5 菌株C發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

2.3.3 菌株C發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌胞外蛋白含量的影響

對(duì)金黃色葡萄菌培養(yǎng)過(guò)程中胞外蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，探究菌株C發(fā)酵液抑制金黃色葡萄球菌的作用途徑.采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法構(gòu)建的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=6.227 6X+0.000 6(R2=0.997 4).菌株C發(fā)酵液在金黃色葡萄球菌發(fā)酵液中比例小于0.4%時(shí)，胞外蛋白質(zhì)含量明顯下降(圖6)，而菌株C發(fā)酵液添加量為0.1%和0.2%時(shí)，對(duì)細(xì)胞外蛋白質(zhì)含量影響不大.整體上，由于菌株C發(fā)酵液并沒(méi)有完全抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，胞外蛋白質(zhì)含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì).已有研究證實(shí)，在藥用植物荊芥提取物抑制酵母生長(zhǎng)過(guò)程中，酵母胞外蛋白含量也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且明顯高于對(duì)照組[27].這與本研究中觀察的到現(xiàn)象相似.

圖6 菌株C發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌胞外蛋白質(zhì)含量變化的影響

2.3.4 菌株C發(fā)酵液對(duì)培養(yǎng)基電導(dǎo)率的影響

菌株C發(fā)酵液添加對(duì)金黃色葡萄球菌菌液電導(dǎo)率并沒(méi)有表現(xiàn)出非常明顯的規(guī)律.然而，不同處理組的不同時(shí)期，與對(duì)應(yīng)對(duì)照組相比，金黃色葡萄球菌菌液的電導(dǎo)率仍有一定的變化,如表2所示.菌液電導(dǎo)率增加表示細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，細(xì)胞內(nèi)離子外流，從而造成菌液中電導(dǎo)率升高[28].然而，細(xì)胞內(nèi)離子外流能引起的電導(dǎo)率變化很小，加之檢測(cè)手段分辨率不夠精確[29]，因而，結(jié)果中并沒(méi)有體現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律.

金黃色葡萄球菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，在生肉、水產(chǎn)及速凍食品中廣泛存在[10,30]，采用中藥抑制金黃色葡萄球菌及其作用機(jī)制的研究是目前研究熱點(diǎn)之一.抑制金黃色葡萄球菌的途徑也不盡相同.紫甘薯花色苷色素可增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞質(zhì)稀薄、解體，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌死亡[31]；五倍子中所含的鞣酸能夠使細(xì)菌體內(nèi)的原生質(zhì)體及蛋白質(zhì)凝固，從而影響菌體代謝致其死亡[32].在本研究中，菌株C的發(fā)酵液可推遲金黃色葡萄球菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其作用機(jī)制極可能是在對(duì)數(shù)期抑制菌體分裂.同時(shí)，引起金黃色葡萄球菌細(xì)胞外蛋白水平升高，電導(dǎo)率發(fā)生變化，也可能是因?yàn)橐志镔|(zhì)作用于細(xì)胞膜，影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性以及功能.

表2 菌株C發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌發(fā)酵液電導(dǎo)率(μs/cm)的影響

3 結(jié)論

從烏頭側(cè)根中分離到4株真菌，根據(jù)ITS序列及形態(tài)學(xué)初步確定菌株A、B、C、D分別屬于Talaromyces(籃狀菌屬)，Penicillium(青霉屬)，Aspergillus(曲霉屬)以及Cladosporium(枝孢霉屬).菌株C對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用，其發(fā)酵液可推遲金黃色葡萄球菌對(duì)數(shù)的生長(zhǎng)期，促進(jìn)金黃色葡萄球菌胞外蛋白質(zhì)含量增加，引起菌懸液電導(dǎo)率變化.因此推測(cè)菌株C發(fā)酵液可能是通過(guò)抑制金黃色葡萄球菌的菌體的分裂增殖和破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)而達(dá)到抑菌效果.在后續(xù)研究中，對(duì)發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)種類及結(jié)構(gòu)的解析將是深入開(kāi)發(fā)烏頭藥用微生物資源的重要研究?jī)?nèi)容.