車金營，楊 碩，許智瑩，李 賀，孫靖輝，陳建光，王春梅

(北華大學藥學院，吉林 吉林 132013)

肝纖維化是慢性肝病或肝損傷后組織修復過程中的一種代償性反應.通常，受外界各種致病因素刺激后，肝臟內炎性細胞活化并釋放相關因子激活肝星狀細胞，引起大量細胞外基質過度沉積，形成纖維化[1].晚期肝纖維化可發(fā)展為肝硬化、肝癌甚至死亡.

五味子(SchisandraChinensis)是木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，木脂素是五味子中主要的特征性活性成分[2].相關研究[3-5]表明：五味子及其提取物具有顯著的抗肝纖維化、肺纖維化及腎纖維化等作用，但對其發(fā)揮作用的主要活性成分方面鮮有報道.五味子酯甲(Schisantherin A，SCA)是五味子木脂素中主要的單體化合物之一，已有研究[6-8]證實：SCA對酒精、對乙酰氨基酚等誘導的肝損傷都有保護作用，且具有顯著的抗炎活性，但其是否具有抗肝纖維化作用尚未報道.本研究采用體外培養(yǎng)LX2細胞，建立TGF-β1誘導LX2細胞增殖模型，觀察SCA對LX2細胞增殖、活化的影響，并探討其抗纖維化作用.

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

五味子酯甲(成都普菲德生物技術有限公司)；人肝星狀細胞LX2細胞系(吉林大學基礎醫(yī)學院藥理學實驗室贈予)；胎牛血清(GEMINI公司)；0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；高糖DMEM培養(yǎng)液(HyClone公司)；TGF-β1(PEPROTECH公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Amresco公司)；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白介素-6(Interleukin-6，IL-6) ELISA試劑盒(上海朗頓生物技術公司)；α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和核因子-κB p65(Nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)及GAPDH(ABclone公司)；其他試劑(北京鼎國昌盛試劑公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將LX2細胞接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM(含1%雙抗)培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng).取對數生長的LX2細胞用0.25%胰蛋白酶消化，以100 μL/孔細胞懸液(6×104/mL)接種至96孔板中，隨機分成10組，并設置復孔，除對照組(CON)外，其余9組每孔分別加入不同濃度的SCA(SCA濃度分別為0.625，1.250，2.500，5.000，10.000，20.000，40.000，80.000和160.000 μmol/L)培養(yǎng)24 h或48 h，采用MTT法檢測LX2細胞增殖作用，結果SCA(0.625～2.500 μmol/L)孵育24或48 h，對LX2細胞無細胞毒性，所以選取SCA濃度小于2.500 μmol/L進行實驗.

1.2.2 MTT法檢測SCA對TGF-β1誘導LX2細胞增殖的影響

將LX2細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以100 μL/孔細胞懸液(6×104/mL)接種至96孔板中，將細胞隨機設立為CON組(含0.1% DMSO)、TGF-β1組(5 ng/mL)與0.25，0.50，1.00和2.00 μmol/L SCA給藥組，培養(yǎng)24 h.采用MTT法檢測各組LX2細胞增殖作用.

1.2.3 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6水平

將消化后的LX2細胞以6×104/mL接種于96孔板中，隨機分為CON組、TGF-β1組與0.25，0.50，1.00和2.00 μmol/L SCA給藥組，孵育24 h，取上清液，應用ELISA試劑盒(朗頓生物技術公司)檢測各組TNF-α和IL-6水平.

1.2.4 Western blotting法檢測α-SMA，NF-κB p65的蛋白表達水平

將胰蛋白酶消化后的LX2細胞以1×106/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液.將細胞隨機分為CON組、TGF-β1組與0.25，0.50，1.00和2.00 μmol/L SCA給藥組，孵育24 h.提取LX2細胞總蛋白.具體步驟：棄去培養(yǎng)瓶中細胞上清液，PBS洗3次，加入RIPA裂解液，冰上裂解細胞30 min，離心(4 ℃、12 000 r/min、5 min)收集上清液，BCA法測定樣本蛋白濃度.在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離目標蛋白，轉膜2 h，隨后封閉1 h(5 %脫脂奶粉)；加入α-SMA，NF-κB p65第一抗體，4 ℃過夜；次日用TBST洗膜3次，10 min/次，并與第二抗體室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次，最后加ECL顯影液顯影，分析.

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 SCA對TGF-β1誘導LX2細胞增殖的影響

與CON組比較，TGF-β1刺激24 h后LX2細胞顯著增殖(P<0.01).而與TGF-β1組比較，SCA (0.25，0.50，1.00和2.00 μmol/L)各給藥組對LX2細胞具有顯著的抑制作用(P<0.05或P<0.01).說明SCA能夠抑制TGF-β1誘導的LX2細胞增殖、活化.見圖1.

2.2 SCA對TGF-β1誘導LX2細胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影響

與CON組比較，TGF-β1組TNF-α和IL-6水平明顯增加(P<0.01).與TGF-β1組比較，SCA各組的TNF-α及IL-6水平均不同程度的降低，且1.00和2.00 μmol/L SCA給藥組TNF-α和IL-6水平降低明顯 (P<0.01).提示SCA可能通過抑制炎癥反應發(fā)揮抗肝纖維化作用.見表1.

注：與CON組比較，**：P<0.01；與TGF-β1組比較，#：P<0.05，##：P<0.01圖1SCA對TGF-β1誘導LX2細胞增殖的影響Fig.1Effects of SCA on the proliferation of LX2 cells induced by TGF-β1

表1SCA對TGF-β1誘導LX2細胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影響

Tab.1 Effect of SCA on TNF-α and IL-6 levels in supernatant of LX2 cells induced by TGF-β1 (ng·mL-1))

注：與CON組比較，**：P<0.01；與TGF-β1組比較，##：P<0.01

2.3 SCA對TGF-β1誘導LX2細胞α-SMA，NF-κB p65蛋白表達的影響

為進一步觀察SCA是否具有抗肝纖維化作用，我們采用Western Blotting法檢測α-SMA的蛋白表達量.結果顯示:與CON組比較，TGF-β1組α-SMA蛋白表達量顯著增加(P<0.01)；與TGF-β1組比較，不同劑量SCA組α-SMA蛋白表達量均有所降低，其中0.50，1.00及2.00 μmol/L SCA給藥組α-SMA蛋白表達量降低顯著 (P<0.05)，提示SCA具有一定的抗肝纖維化作用.見圖2A.

同時，為探討NF-κB信號通路在SCA抗肝纖維化中是否發(fā)揮作用，我們檢測了NF-κB p65蛋白表達量.與CON組比較，TGF-β1組NF-κB p65蛋白表達量明顯增加(P<0.05).與TGF-β1組比較，SCA各組NF-κB p65蛋白表達量均有所降低，其中1.00 μmol/L及2.00 μmol/L SCA給藥組NF-κB p65蛋白表達量明顯下降(P<0.05).提示SCA可能通過抑制NF-κB p65蛋白表達發(fā)揮抗肝纖維化作用.見圖2B.

注：與CON組比較，*：P<0.05，**：P<0.01；與TGF-β1組比較，#：P<0.05圖2SCA對LX2細胞中α-SMA，NF-κB p65蛋白表達的影響Fig.2Effect of SCA on the expression of α-SMA and NF-κB p65 in LX2 cells

3 討 論

木脂素是五味子發(fā)揮保護肝損傷作用的主要活性成分.SCA是五味子木脂素單體化合物之一，除了保護肝損傷，還具有顯著的抗炎活性[9].肝纖維化主要是由于肝星狀細胞的激活，產生過量的α-SMA及細胞外基質沉積于肝臟內，致使纖維結締組織異常增生[10].因此，抑制肝星狀細胞增殖、活化對抗肝纖維化具有重要意義.本研究采用體外培養(yǎng)LX2細胞，建立TGF-β1誘導LX2細胞增殖模型，觀察SCA對LX2細胞增殖、活化作用.本研究結果顯示：SCA能夠顯著抑制LX2細胞增殖活化，降低α-SMA蛋白表達水平，提示SCA具有一定的抗肝纖維化作用.

在肝纖維化進程中，肝組織內會釋放大量的炎性介質及細胞因子，包括TNF-α和IL-6等[11]，這些炎癥因子會刺激肝星狀細胞，促進肝纖維化，在這一過程中NF-κB信號通路發(fā)揮重要的作用[12].本研究結果顯示：SCA能夠明顯降低TNF-α及IL-6的水平，并抑制NF-κB p65的蛋白表達，說明SCA可能通過抑制炎癥相關因子TNF-α，IL-6的表達及NF-κB信號通路的激活而發(fā)揮抗肝纖維化作用.

綜上所述，SCA能夠抑制TGF-β1誘導的LX2細胞增殖、活化及α-SMA表達，其抗肝纖維化作用機制可能與抑制炎癥反應及NF-κB信號通路有關，這為五味子木脂素類化合物抗肝纖維化的研究提供了一定的理論基礎.