閆喜惠，劉艷波，王志強(qiáng)，郭 鵬

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

糖尿病是影響機(jī)體多個(gè)器官的全球性健康問(wèn)題，可引起腎臟蛋白尿、腎病綜合征，并最終導(dǎo)致腎功能衰竭[1].高尿葡萄糖水平會(huì)導(dǎo)致尿滲透壓升高，從而降低腎臟對(duì)水的吸收，最終導(dǎo)致多尿[2].盡管持續(xù)的多尿可引起嚴(yán)重脫水，但是嚴(yán)重脫水在糖尿病患者中很少發(fā)生.因此，人們認(rèn)為腎臟有一種減輕糖尿病脫水的補(bǔ)償機(jī)制.AQP-1是調(diào)節(jié)跨細(xì)胞在細(xì)胞膜上運(yùn)動(dòng)的膜結(jié)合蛋白，在腎小管水的再吸收中具有至關(guān)重要的作用[3].

最近的一些研究[4-6]已經(jīng)使用磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像方法來(lái)評(píng)價(jià)糖尿病腎病患者的腎功能，然而，表觀(guān)擴(kuò)散系數(shù)(ADC)很容易受到體內(nèi)生理變化(如腎小管液體流動(dòng)和血管內(nèi)液體流動(dòng))的影響，磁共振IVIM成像可將真實(shí)擴(kuò)散系數(shù)和各種灌注相關(guān)擴(kuò)散系數(shù)區(qū)分開(kāi).另外，通過(guò)IVIM成像有助于揭示AQP的表達(dá).

1 資料和方法

1.1 一般資料

所有實(shí)驗(yàn)均按照北華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行.45只雄性家兔分為對(duì)照組(n=15)、1型糖尿病組(n=15)、2型糖尿病組(n=15).1型糖尿病組家兔造模：150 mg/kg四氧嘧啶經(jīng)耳緣靜脈注射，4周后，血糖濃度≥16 mmol/L，入選1型糖尿病組.2型糖尿病組家兔造模：高脂高糖喂養(yǎng)，并將蔗糖按1 g/mL溶解于飲用水中，8周后，家兔血糖濃度≥16 mmol/L，入選2型糖尿病組.

1.2 磁共振檢查方法

所有動(dòng)物進(jìn)行MRI檢查，使用磁共振掃描儀(3.0T，GE Healthcare，Milwaukee，WI)和動(dòng)物線(xiàn)圈，應(yīng)用30 mg/kg戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉動(dòng)物.掃描參數(shù):冠狀面掃描5層，層厚=2.5 mm，b=10，50，100，200，400，600，800，1 200 s/mm2，F(xiàn)OV=1 cm×16 cm，Tr=4 050 ms，TE=96.3 ms，NEX=2，TIME=6 mim 41 s.測(cè)量家兔腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓的SADC，D，D*值.

1.3 腎臟免疫組織化學(xué)

所有家兔在MRI后立即取腎組織樣本，應(yīng)用100 mg/kg戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射，致家兔安樂(lè)死.用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶技術(shù)對(duì)5 μm石蠟包埋組織切片，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色.石蠟切片后進(jìn)行分離、水化，并被抗原回收和內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性阻斷.用AQP-1單克隆抗體(1/A5F6；1∶200；NOVUS，Littleton，CO，USA)在4 ℃下孵育一夜，然后與非生物素(ELVISIONTMSuperkit-9922，MAYXIN，中國(guó)福州)試劑a和b分別孵育15 min，使辣根過(guò)氧化物酶聚合物與原抗體結(jié)合.應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺染色，然后用蘇木精染色.

分別拍攝每個(gè)腎臟3個(gè)解剖層的高分辨率圖像(×400)，分析AQP-1染色，計(jì)算AQP-1染色所覆蓋的區(qū)域.我們對(duì)OD值進(jìn)行了3次測(cè)量，并對(duì)結(jié)果取均值.見(jiàn)圖1.由圖1可見(jiàn)，1型糖尿病組和2型糖尿病組腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓AQP-1免疫組化染色明顯高于對(duì)照組.

圖13組家兔腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓水通道蛋白-1 (AQP-1)免疫組化Fig.1Immunohistochemistry of renal cortex，outer med- ulla and inner medulla aquaporin-1 (AQP-1) of rabbits in three groups

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

1型和2型糖尿病組各參數(shù)之間無(wú)差異.與對(duì)照組比較，糖尿病家兔體質(zhì)量減輕，血糖升高(P<0.001).統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1.糖尿病組中腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓真實(shí)擴(kuò)散系數(shù)D值顯著高于對(duì)照組；糖尿病組AQP-1在腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1).真實(shí)擴(kuò)散系數(shù)D值與腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓AQP-1表達(dá)的OD值呈正相關(guān)(見(jiàn)圖2).腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓各解剖層都呈現(xiàn)顯著正相關(guān).

表1 3組家兔的特征Tab.1 Characteristics of rabbits in the three groups

圖2水通道蛋白-1(AQP-1)表達(dá)的光密度(OD)值與真實(shí)擴(kuò)散系數(shù)(D值)之間的相關(guān)性Fig.2Correlation between optical density (OD) values for aquaporin-1 (AQP-1) expression and pure molecular diffusion (D values)

3 討 論

我們采用四氧嘧啶給家兔靜脈注射誘導(dǎo)1型糖尿病模型，采用高脂肪高糖喂養(yǎng)的方法誘導(dǎo)2型糖尿病模型，結(jié)果這些動(dòng)物出現(xiàn)了糖尿病的特征，如胰島素分泌減少和代謝綜合征癥狀[7].所有高脂飲食和四氧嘧啶處理的家兔均出現(xiàn)典型的高血糖、尿量增加和體質(zhì)量減輕的糖尿病癥狀.

在糖尿病腎病的進(jìn)展過(guò)程中，主要的病理變化包括纖維化、腎功能受損以及慢性腎臟疾病，所有這些都與ADC的降低有關(guān)[8].然而，在我們的研究中，1型和2型糖尿病組與對(duì)照組動(dòng)物腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓的SADC，D*沒(méi)有明顯的變化，這些結(jié)果與CAKMAK等[9]的結(jié)果一致，對(duì)照組與糖尿病早期階段之間的ADC沒(méi)有顯著差異.

IVIM磁共振成像參數(shù)D值有可能成為糖尿病腎病早期診斷的一種有前途的測(cè)定方法.此外，D值低于SADC值和D*值，這與掃描中b值越高、腎臟ADC越低的結(jié)論相一致[10].以往單指數(shù)模型得到的ADC值并不能真實(shí)反映組織的生理活動(dòng)，因?yàn)樗粌H包含有關(guān)擴(kuò)散的信息，還包含灌注和流動(dòng)效應(yīng)的信息.D*值代表的擴(kuò)散信號(hào)強(qiáng)度主要反應(yīng)腎臟中的快速血液灌注情況.D值代表的擴(kuò)散信號(hào)強(qiáng)度主要與水分子擴(kuò)散有關(guān).雙指數(shù)模型公式：Sb/S0=(1-f)·exp(-b·D)+f·exp(-b·D*)，采用多b可以同時(shí)評(píng)價(jià)腎組織水分子真實(shí)擴(kuò)散系數(shù)(D)和血流微循環(huán)灌注相關(guān)擴(kuò)散系數(shù)(D*)，并將兩者區(qū)分開(kāi)來(lái).根據(jù)D，SADC和D*擴(kuò)散信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)系，D值可能對(duì)較慢的擴(kuò)散成分反應(yīng)敏感，因?yàn)槲覀冊(cè)诒狙芯恐杏^(guān)察到了真實(shí)擴(kuò)散系數(shù)D值最低.此外，我們的結(jié)果表明：D值比SADC值和D*值對(duì)能量代謝或重吸收更敏感.

在最近的研究[11]中，ADC和AQP在細(xì)胞膜中表達(dá)之間的關(guān)系已經(jīng)引起了人們的關(guān)注.一項(xiàng)使用磁共振擴(kuò)散成像對(duì)帕金森病的臨床研究表明：ADC可能有助于闡明AQP的功能.另外，水通道蛋白在膜中傳輸水的速度比細(xì)胞間隙間的水?dāng)U散速度慢0.45×10-3mm/s[12].水通道蛋白在腎臟的分布非常廣泛，表達(dá)在腎近曲小管以及亨勒袢降支的質(zhì)膜上，對(duì)腎小管水的再吸收起著重要的作用.而糖尿病患者滲透性利尿與腎臟水的調(diào)控有著重要的關(guān)系，AQP-1表達(dá)增加可能是一種減輕脫水的代償機(jī)制.此外，我們的研究顯示：D值的變化與AQP-1表達(dá)的變化呈正相關(guān)，但相關(guān)性有限.因此，基于這些發(fā)現(xiàn)，磁共振IVIM成像參數(shù)D值能夠評(píng)估AQP-1對(duì)水的運(yùn)輸.

本研究存在一些局限性.首先，我們只測(cè)量了糖尿病模型的一個(gè)時(shí)間點(diǎn).其次，樣本量相對(duì)較少.

總之，與對(duì)照組相比，糖尿病組中腎皮質(zhì)、外髓、內(nèi)髓的D值和AQP-1的表達(dá)均明顯增高(P<0.05).因此，我們認(rèn)為AQP-1在緩解糖尿病合并多尿癥引起的脫水方面具有重要作用，真實(shí)擴(kuò)散系數(shù)D值的變化可以反映AQP-1的功能.