李聰聰 張永輝 趙婉霞 吳姣 韓浩園 李夢云牛暉 宋素芳 李婉濤

（1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物科技學(xué)院，鄭州 450046；2. 河南省畜禽遺傳資源保護(hù)工程技術(shù)研究中心，鄭州 450046；3. 鄭州市動物生殖分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046）

CRISPR/Cas系統(tǒng)是由RNA介導(dǎo)的對DNA修飾的基因編輯工具，該技術(shù)可以對基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行缺失、插入、修復(fù)等靶向編輯，是目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新技術(shù)。CRISPR/Cas系統(tǒng)是人們在古細(xì)菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫機(jī)制。該系統(tǒng)有 3種類型：TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ［1］，TypeⅠ和TypeⅢCRISPR/Cas系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈，其中僅存在于細(xì)菌的TypeⅡ系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，而且體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明Cas9基因是參與CRISPR免疫系統(tǒng)唯一的必須基因［2-3］，由于其簡易性和可操作性，TypeⅡ系統(tǒng)已被改造為最成功的人工核酸酶［4］，最有力的基因編輯工具，成為基因編輯領(lǐng)域最炙手可熱的技術(shù)。Cas9是一種內(nèi)切酶，具有RuvC-like結(jié)構(gòu)域和HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域兩個(gè)內(nèi)切酶活性中心。Jinek等［5］發(fā)現(xiàn)Cas9對雙鏈DNA的切割作用，需要crRNA（CRISPR-derived RNA）和tracrRNA（trans-activating RNA）的介導(dǎo)。具體來說：crRNA和tracrRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合形成一個(gè)嵌合RNA分子，被稱為向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）。這個(gè)sgRNA與Cas9相互結(jié)合形成蛋白-RNA復(fù)合體，該復(fù)合體中的Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，其中HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域切斷與crRNA互補(bǔ)的一條鏈，RuvC-like結(jié)構(gòu)域切斷非互補(bǔ)鏈，形成DSB（DNA doublestrand breaks）［4］，引起細(xì)胞的 NHEJ修復(fù)機(jī)制。該過程即是CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯分子基礎(chǔ)。

miR-155促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞分化，調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，在機(jī)體抵抗感染中發(fā)揮重要作用。miR-155基因是重要的抗病候選基因。大量研究表明，miR-155在機(jī)體造血細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)答等生物過程中發(fā)揮重要作用［6］。miR-155是對免疫細(xì)胞的活化及炎癥因子的表達(dá)具有調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。Rodriguez等［7］通過miR-155敲除小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-155是機(jī)體維持正常免疫活動所必須的。MiR-155通過在活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)來調(diào)節(jié)機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)。在B細(xì)胞成熟過程中，miR-155靶向調(diào)控c-Maf、PU.1和AID等基因，促進(jìn)記憶性B細(xì)胞的形成［8］。MiR-155通過靶向 SOCS1和 c-Maf，調(diào)控Th1/Th2分化平衡的機(jī)制［9］。MiR-155參與調(diào)控Th17和Th1細(xì)胞亞群的分化［10-11］，而且在慢性移植排斥反應(yīng)中，miR-155調(diào)控Th1/Th17相關(guān)的免疫反應(yīng)［12］。MiR-155參與CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，miR-155缺失可抑制CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，miR-155超表達(dá)可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答［13］。MiR-155通過TLR信號通路途徑可被細(xì)菌（LPS）和病毒（Poly I：C）的復(fù)合物誘導(dǎo)表達(dá)，也可被TNFα和干擾素（IFN-β，IFN-γ）誘導(dǎo)表達(dá)［14-17］。一些參與TLR誘導(dǎo)的信號級聯(lián)放大的基因 FADD、IKKε、Ripk1、TAB2、SOCS1都是 miR-155 的靶基因［7，18-20］。這些研究表明 miR-155在機(jī)體先天性免疫中發(fā)揮重要作用，即miR-155調(diào)控機(jī)體炎癥。大量研究表明miR-155的表達(dá)水平與炎癥因子的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)，是個(gè)親炎癥（Proinflammtory）分子。本課題組用LPS、Poly（I∶C）分別刺激PK15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-155對TLR3/4發(fā)揮正調(diào)控作用［21］。另有研究用土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）感染人單核細(xì)胞，檢測到miR-155表達(dá)顯著增加，并且上調(diào)表達(dá)的miR-155對促炎因子TNFα、IL1β、IL6的生成發(fā)揮正調(diào)控作用［22］。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血中，miR-155的表達(dá)水平與炎癥因子TNF-α、IL1β的釋放存在正相關(guān)［23］。前人及我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-155不但調(diào)控多種免疫細(xì)胞成熟、分化，而且當(dāng)機(jī)體受細(xì)菌或病毒侵染時(shí)，miR-155迅速上調(diào)以激活機(jī)體炎癥反應(yīng)，清除病原。Wang等［24］用RNA病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，miR-155上調(diào)表達(dá)，并靶向抑制SOCS1表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)I型干擾素信號通路，達(dá)到減弱病毒復(fù)制的目的。在研究人類艾滋病中，Poly（I∶C）刺激單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞時(shí)，高表達(dá)的miR-155能夠抑制HIV-1的感染，也即miR-155在機(jī)體對抗病毒過程中發(fā)揮積極作用［25］。以上研究表明miR-155是重要的抗病候選基因。

存在機(jī)體組織微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，具有吞噬、抗原加工與遞呈、免疫調(diào)節(jié)等生理功能，在機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。豬體受到細(xì)菌（豬沙門氏菌、副豬嗜血桿菌）或病毒（豬藍(lán)耳病）感染后，常常首當(dāng)其沖受到影響的是巨噬細(xì)胞，如肺泡巨噬細(xì)胞。大量研究數(shù)據(jù)表明細(xì)菌（如副豬嗜血桿菌）感染削弱巨噬細(xì)胞的免疫力導(dǎo)致豬對細(xì)菌易感［26］，病毒（豬藍(lán)耳?。└腥疽种凭奘杉?xì)胞的功能形成嚴(yán)重免疫抑制導(dǎo)致豬體對其它病毒性疾病和細(xì)菌性疾病易感性明顯增加［27］。本研究選定重要的抗病候選基因miR-155，采用改良的CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建miR-155敲除的豬肺泡巨噬細(xì)胞系，為探討miR-155在巨噬細(xì)胞發(fā)揮的調(diào)控功能研究提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin（Addgene：#51133）和pEGFP-C1-cas9為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)謝勝松副教授課題組饋贈，3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙書紅教授課題組饋贈。引物合成和測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA設(shè)計(jì)及表達(dá)載體構(gòu)建 利用sgRNAcas9軟件在ssc-miR-155前體區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性的sgRNA引物，引物名稱分別為sgRNA39F/R、sgRNA42F/R、sgRNA51F/R、sgRNA52F/R（ 表 1），以 pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin（Addgene：#51133，簡寫pGL3-U6-sgRNA）載體為骨架構(gòu)建表達(dá)載體。提取包含4條sgRNA靶位點(diǎn)及ssc-miR-155前體序列在內(nèi)的696 bp基因組序列，用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)最佳的PCR擴(kuò)增引物對ssc-miR-155F/R（表1），引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建步驟為：取濃度為10 μmol/L的前向與反向引物各5 μL在PCR儀上用 95℃，10 min；65℃，1 h；pGL3-U6-gRNA質(zhì) 粒用BsaI酶（NEB北京）進(jìn)行酶切，酶切回收備用，連接退火后的sgRNA；將退火后的sgRNA稀釋100倍，取1 μL與酶切的pGL3-U6-gRNA質(zhì)粒，使用T4 DNA連接酶（寶生物工程（大連）有限公司）16℃連接1 h；取2 μL連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞（寶生物工程（大連）有限公司）中，涂布到加了氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，挑選用PCR擴(kuò)增（此時(shí)用U6左引物和sgRNA右引物鑒定陽性克?。╄b定成功的單克隆菌液，送生工生物工程（上海）股份有限公司用“U6seqF”引物測序鑒定，將靶向ssc-miR-155前體的不同位置sgRNA表達(dá)載體分別命名為：sgRNA51、sgRNA52、sgRNA42和 sgRNA39。測序正確的陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Endo-free Plasmid DNA Mini Kit Ⅱ，Omega Bio-Tek）抽提表達(dá)質(zhì)粒，測定濃度后備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及流式分選 3D4/21細(xì)胞培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的1640（Gibco）培養(yǎng)基，在CO2濃度為5%，溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前接種一個(gè)6孔板，每孔接種細(xì)胞量為1.2×105個(gè)，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期且密度接近80%左右時(shí)，按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分組轉(zhuǎn)染（對照組：pGL3-U6-sgRNA空載+ pEGFP-C1-cas9；實(shí)驗(yàn)組：pGL3-U6-sgRNA39/42/51/52+ pEGFPC1-cas9；第三組：pEGFP-C1-cas9），于轉(zhuǎn)染48 h后收集所有細(xì)胞。若進(jìn)行流式分選GFP陽性細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染24 h后收集所有細(xì)胞，轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞儀（BD FACSJazz，美國）進(jìn)行分選，分選后的細(xì)胞添加含有1%雙抗的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集所有細(xì)胞。利用基因組DNA小量抽提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司），抽提不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞基因組DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與T7EI酶酶切鑒定、測序分析 以上述抽提的細(xì)胞DNA為模板，利用表1中的引物ssc-miR-155F/R，在Q5超保真 DNA 聚合酶（NEB，北京）作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30 s，98℃變性10 s，64℃退火復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用PCR純化試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，接下來嚴(yán)格按照T7EI核酸酶（NEB，北京）的說明書進(jìn)行操作：取200 ng純化之后的PCR產(chǎn)物，加入2 μL NEBuffer 2，補(bǔ)充無核酸酶水至19μL，在PCR儀上進(jìn)行梯度退火雜交，程序?yàn)椋?5℃變性5 min；95-85℃，每秒降低2℃（-2℃/s）；85-25℃，每秒降低 0.1℃（-0.1℃/s）；取 1 μLT7EI核酸酶，在PCR儀上37℃切割雜交的PCR產(chǎn)物15 min，然后在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，基因組突變的泳道將會出現(xiàn)小分子量條帶。進(jìn)一步，取純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行加A反應(yīng)（天根生化科技（北京）有限公司），而后取加A后產(chǎn)物與pMD-19T載體（寶生物工程（大連）有限公司）進(jìn)行TA克隆，DH5α感受態(tài)細(xì)胞（寶生物工程（大連）有限公司）轉(zhuǎn)化，涂平板，挑選單克隆在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液PCR鑒定為陽性克隆后送工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.4 細(xì)胞RNA提取及qRT-PCR 取1.2.2收集的 細(xì) 胞， 加 入 TRIzol（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，USA），按照RNA提取步驟提取每個(gè)樣品的總RNA，測定濃度后備用。用DNAseⅠ（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，USA）對提取的總RNA去 除 基因組 DNA，反應(yīng)體 系：1 μg總 RNA，1μL10×Reaction Buffer，1 μL（1U）DNase Ⅰ（RNasefree），補(bǔ)DEPC水至總體積10 μL，37℃反應(yīng)30min。加 入 1 μL 50 mmol/L EDTA， 在 PCR 儀 上 65℃ 孵育10 min，終止反應(yīng)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，USA）的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA合成步驟：1 μg去除基因組DNA后的總RNA，1 μL莖環(huán)引物（RT-ssc-miR-155-5p/ RT-ssc-miR-155-3p），補(bǔ) Nuclease-Free Water 至12 μL 構(gòu)成mix1，65℃孵育5 min，而后立即置于冰上 2 min ；4 μL 5×Reaction Buffer，1μL RiboLockTM RNase inhibitor，2 μL 10 mmol/L dNTP mix，1 μL RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase，將mix1和mix2混勻離心，設(shè)置反應(yīng)程序：42℃，60 min；70℃，5 min；15℃，2 min。 反 應(yīng) 結(jié) 束，-20℃ 保存。以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，對ssc-miR-155-5p，ssc-miR-155-3p表達(dá)量進(jìn)行檢測分析，各基因檢測引物見表1。qPCR 反應(yīng)體系 ：7.5 μL 2×SYBR?Green Real-time PCR Master Mix（Toyobo， 上 海 ），50 pmol引 物，75 ng模 板 cDNA， 補(bǔ) 水 至 15 μL。ABI7500 Fast 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。擴(kuò)增程序 ：95℃，5 min（Holding stage）；95℃，15 s；60℃，34 s；72℃，15 s（Cycling stage，40 cycles）；95℃，30 s；58℃，34 s；95℃，15 s；60℃，15 s（Melt Curve Stage）。

1.2.5 Western blotting 取1.2.2所收集細(xì)胞，加RIPA裂解液（強(qiáng)）+1mmol/L PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟）（碧云天，上海）裂解細(xì)胞。選用8%SDS-PAGE膠，上樣量為30μg。本實(shí)驗(yàn)所用一抗有SHIP1（bs-3567R，博奧森Bioss），抗體稀釋比 1∶500；beta-Actin（bsm-33036M，博奧森 Bioss），抗體稀釋比1∶1000；熒光二抗StarBrightTMBlue 700 Goat Anti-Rabbit IgG（#12004162，伯樂），抗體稀釋比為1∶10000；DyLight 800 Goat Anti-Mouse IgG（#STAR117D800GA，伯樂），抗體稀釋比為1∶5000。最后在Bio-Rad ChemiDoc MP全能型成像系統(tǒng)中顯色。采用Bio-Rad Image Lab software進(jìn)行圖像分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 qPCR數(shù)據(jù)由相對定量2-△△Ct法進(jìn)行分析［28］，U6作為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_(dá)水平進(jìn)行校正。用非配對的t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)差異顯著性，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 合成 sgRNA引物并構(gòu)建載體

根據(jù)在線CRISPR設(shè)計(jì)結(jié)果，合成評分較高的sgRNA引物序列（表1），pGL3-U6-sgRNA重組載體信息（圖1），成功構(gòu)建靶向ssc-miR155的pGL3-U6-sgRNA載體。

2.2 miR-155基因敲除的3D4/21細(xì)胞的制備

正常培養(yǎng)3D4/21細(xì)胞至密度為80%左右，用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，pGL3-U6-sgRNA39/42/51/52+pEGFP-C1-cas9為實(shí)驗(yàn)組；pGL3-U6-sgRNA空載+ pEGFP-C1-cas9為對照（Control）組；只轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-cas9質(zhì)粒通過綠色熒光GFP的表達(dá)來檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染是否成功。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組的3D4/21細(xì)胞多數(shù)表達(dá)綠色熒光，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞成功（圖2）。

2.3 MiR-155在3D4/21細(xì)胞基因組中敲除效率的檢測

收集轉(zhuǎn)染后的3D4/21細(xì)胞提取基因組DNA后，以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增包含miR155前體序列的696 bp的片段，PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化以后，按照T7EⅠ核酸酶的說明書進(jìn)行操作，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。隨后用ImageJ定量軟件計(jì)算切割效率，發(fā)現(xiàn)sgRNA51、sgRNA52、sgRNA42和sgRNA39均靶向敲除成功，流式分選前的sgRNA39、sgRNA42、sgRNA51、sgRNA52切割效率分別27%、32%、29%和28%，流式分選后分別為42%、41%、38%、36%（圖3）。

表1 構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體引物、基因組擴(kuò)增引物及熒光定量PCR引物信息

2.4 敲除miR-155的3D4/21細(xì)胞中缺失或插入位點(diǎn)測序驗(yàn)證

提取sgRNA39、sgRNA42、sgRNA51、sgRNA52實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接19T載體，轉(zhuǎn)化后挑單克隆送上海生工公司進(jìn)行Sanger測序。分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sgRNA39介導(dǎo)的Cas9核酸酶在靶點(diǎn)位置造成了31 bp、18 bp的缺失，sgRNA42介導(dǎo)的Cas9核酸酶在靶點(diǎn)位置造成了21 bp、11 bp的缺失，sgRNA51介導(dǎo)的Cas9核酸酶在靶點(diǎn)位置造成了24 bp、9 bp的缺失，sgRNA52介導(dǎo)的Cas9核酸酶在靶點(diǎn)位置造成了2 bp的缺失和插入 1 bp（圖 4）。

2.5 敲除miR-155的3D4/21細(xì)胞中miR-155相對表達(dá)量的檢測

為檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)對3D4/21細(xì)胞內(nèi)源miR-155的表達(dá)水平的影響，將轉(zhuǎn)染pGL3-U6-sgRNA和pEGFP-C1-cas9質(zhì)粒的細(xì)胞收集之后提RNA進(jìn)行qPCR檢測。qPCR結(jié)果顯示，不管是miR-155-3p還是miR-155-5p，對照組都呈現(xiàn)高表達(dá)（對照組的表達(dá)量已標(biāo)準(zhǔn)化為1，圖5）。與對照組相比，sgRNA39和sgRNA42實(shí)驗(yàn)組的miR-155-3p的表達(dá)量呈現(xiàn)極顯著下調(diào)（P＜0.01），sgRNA51的miR-155-3p的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05），sgRNA52的miR-155-3p的表達(dá)量沒有下調(diào)，反而有少許增加；sgRNA39、sgRNA42、sgRNA51和 sgRNA52實(shí)驗(yàn)組的miR-155-5p的表達(dá)量均表現(xiàn)為顯著下調(diào)（P＜0.05）。不管是miR-155-3p還是miR-155-5p，sgRNA39實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量都是顯著下調(diào)最明顯的，暗示sgRNA39的敲除效率最高。

圖1 構(gòu)建靶向ssc-miR155的pGL3-U6-sgRNA載體

2.6 免疫印跡檢測敲除miR-155的3D4/21細(xì)胞中靶基因表達(dá)水平

為了檢測敲除miR-155的3D4/21細(xì)胞中，已驗(yàn)證的靶基因SHIP1的蛋白表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-155的敲除效率，將轉(zhuǎn)染pGL3-U6-sgRNA和pEGFPC1-cas9質(zhì)粒的表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的3D4/21細(xì)胞進(jìn)行流式分選，富集表達(dá)GFP的細(xì)胞后提取蛋白樣品，采用western blot方法進(jìn)行miR-155靶基因SHIP1蛋白表達(dá)量的檢測。結(jié)果（圖6）顯示，敲除miR-155的3D4/21細(xì)胞中，miR-155基因已驗(yàn)證的靶基因SHIP1呈現(xiàn)高表達(dá)，特別是敲除效率比較高的sgRNA39，實(shí)驗(yàn)組SHIP1表達(dá)量與對照組相比呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)（P＜0.01）。

圖2 pGL3-U6-sgRNA與pEGFP-C1-cas9載體共轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞系（10×）

圖3 T7EⅠ酶酶切檢測sgRNA的切割效率

圖4 Sanger測序結(jié)果

3 討論

采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯，sgRNA的設(shè)計(jì)非常重要。Jing等［29］采用pLentiCRISPR系列慢病毒載體針對小鼠mmu-miR-155種子序列設(shè)計(jì)sgRNA構(gòu)建表達(dá)載體，感染RAW264.7細(xì)胞后，建立單克隆細(xì)胞系，DNA測序結(jié)果顯示 mmu-miR-155最多被敲除6 bp，qPCR結(jié)果顯示mmu-miR-155的mRNA表達(dá)水平降低一半，正常培養(yǎng)條件下，靶蛋白SHIP1的表達(dá)量有少許上調(diào)，敲除效率不及本實(shí)驗(yàn)。最主要的原因可能是sgRNA引物的設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)sgRNA是針對ssc-miR-155-3p序列設(shè)計(jì)的，所選4個(gè)sgRNA引物序列是評分較高的，其中sgRNA39評分最高，特別高于針對ssc-miR-155-5p序列設(shè)計(jì)的sgRNA；DNA測序顯示sgRNA39敲除31 bp，qPCR結(jié)果顯示sgRNA39敲除細(xì)胞中ssc-miR-155-3p表達(dá)量下調(diào)8倍多，ssc-miR-155-5p表達(dá)量下調(diào)10倍多；靶蛋白SHIP1的表達(dá)量上調(diào)8倍。

本實(shí)驗(yàn)中qPCR結(jié)果顯示sgRNA52敲除細(xì)胞中ssc-miR-155-3p的表達(dá)量沒有降低反而有少許上升，此反常現(xiàn)象可能的原因有：sgRNA52敲除效率是其中最低的，DNA測序結(jié)果顯示有2 bp的敲除，或者是1 bp的插入。miR-155-3p/5p均參與真核基因表達(dá)調(diào)控，并且miR-155-3p/5p可通過兩者表達(dá)量比值的改變來發(fā)揮調(diào)節(jié)功能［30］。本實(shí)驗(yàn)中sgRNA52敲除效率最低，而且測序結(jié)果顯示有堿基插入或與參考序列一致，造成mRNA表達(dá)水平異常。

基因組編輯技術(shù)是研究基因功能的一個(gè)新型的重要工具。在CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)之前，在細(xì)胞水平進(jìn)行基因的功能研究主要采用RNAi技術(shù)。但RNAi屬于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，具有不徹底性，可能對基因功能的正確判斷有影響，CRISPR/Cas9技術(shù)可以在基因組水平敲除目的基因，更適用于基因功能的研究［31］。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了miR-155敲除的3D4/21細(xì)胞株，解決了RNAi技術(shù)的瞬時(shí)性和不徹底性對基因功能研究的影響，在細(xì)胞水平上為更進(jìn)一步深入研究miR-155的功能提供了更為有效的工具。

圖5 qPCR檢測miR155-3p和miR155-5p在不同敲除細(xì)胞中的表達(dá)水平

圖6 Western blot驗(yàn)證miR-155靶基因SHIP1蛋白在敲除細(xì)胞中的表達(dá)量

4 結(jié)論

本研究采用帶有GFP標(biāo)記基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞，采用流式分選并富集表達(dá)GFP的細(xì)胞，收集細(xì)胞后分別在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平檢測敲除效率，結(jié)果顯示T7EI酶酶切檢測有小分子片段，Sanger測序顯示在sgRNA附近位點(diǎn)有堿基敲除，qPCR檢測miR-155-5p/3p表達(dá)量均有下降，western blot結(jié)果表明miR-155靶基因SHIP1的蛋白表達(dá)量升高。即成功構(gòu)建miR-155敲除的3D4/21細(xì)胞系，為進(jìn)一步探討miR-155在巨噬細(xì)胞發(fā)揮的調(diào)控功能研究提供細(xì)胞模型。