劉昌明 黃香塵 杜 斌

(雅安職業(yè)技術學院病理教研室，雅安625000)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第9位，并有逐年增長的趨勢[1]。而miR-503是一種在染色體Xq26.3位點與miRNA-424結合的基因內(nèi)小RNA，其與乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌和肺癌等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關[2]。但關于miR-503-5p的報道并不多，主要是抑制成骨分化和腫瘤細胞增殖[3-5]。并已有報道發(fā)現(xiàn)miR-503-5p通過干擾Rb/E2F信號通路來抑制膀胱癌細胞T24的增殖[4]，但miR-503-5p對膀胱癌細胞T24的侵襲和遷移的作用及機制并不清楚。堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor ，bFGF)能夠促進腫瘤細胞的遷移，誘導腫瘤相關成纖維細胞分化，促進腫瘤的生長[6]。Horstmann等[7]發(fā)現(xiàn)bFGF的表達程度反映了腎癌的侵襲性，Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)bFGF通過誘導調(diào)控Ets-1和uPA的表達增強體外卵巢癌細胞的侵襲能力，所以bFGF和腫瘤細胞的侵襲遷移具有一定關系。本文主要研究miR-503-5p對膀胱癌細胞T24侵襲和遷移的調(diào)節(jié)作用及機制，為后期膀胱癌的治療和診斷提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料 人膀胱癌細胞T24購自上海雅吉生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco BRL公司；miR-503-5p mimic、pcDNA-bFGF質(zhì)粒由上海生工生物工程有限公司合成。LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國ABI公司；Dual Luciferase報告基因試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司；Transwell小室購自美國 Corning 公司；BCA試劑盒購自北京天根生化有限公司；鼠購自四川大學生物治療國家重點實驗室[許可證：SYXK(川)2016-178]。

1.2方法

1.2.1靶基因預測 運用在線基因預測軟件：TargetScan (http://www.targetscan.org)和miRanda(http://www.microna.org/microrna/home.do)預測miR-503-5p的靶基因。

1.2.2細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人膀胱癌細胞T24于含10% 胎牛血清和100 mg/L青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。膀胱癌細胞T24培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染，將miR-503-5p mimic和pcDNA-bFGF單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞T24。

1.2.3RT-PCR 用Trizol試劑提取細胞或組織的總RNA，按試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行RT-PCR檢測。反應條件為：95℃預變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；4℃保存。miR-503-5p引物，由生工生物工程上海股份有限公司采用PolyA 加尾法設計合成；bFGF上游引物：5′-CACCAACTGCAGATGGCAGCCGGG-AGCATC-3′，bFGF下游引物：5′-ACGCGTCGACTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAA-3′。β-actin作為內(nèi)參，應用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One 軟件進行掃描分析，計算采用2-ΔΔCt法。

1.2.4雙熒光素酶報告實驗 用miR-503-5p mimic、pc-DNA、pcDNA-bFGFwt和pcDNA-bFGFmut分別或同時對細胞進行轉(zhuǎn)染，以海腎熒光素酶的熒光值作為內(nèi)參，按照Dual Luciferase報告基因試劑盒說明書進行。

1.2.5Transwell檢測 接種膀胱癌細胞T24細胞懸液100 μl/室于Transwell小室上室，使transwell小室上室細胞終濃度為8×104個/室。然后，向下室加入750 μl 含血清培養(yǎng)基。最后，在培養(yǎng)48 h后取出Transwell 小室，用結晶紫染色，顯微鏡下隨機拍照，收集試驗數(shù)據(jù)分析。

1.2.6劃痕實驗 將各組膀胱癌細胞T24消化鋪滿單層后用小號槍頭垂直劃痕，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別在顯微鏡下拍照，用 Image J 軟件分析。

1.2.7Western blot檢測 膀胱癌細胞T24裂解變性后，用BCA試劑盒檢測蛋白含量。取25 μg總蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)印至 PVDF膜后,在室溫下用 5% 脫脂奶粉封閉 1 h,加入對應一抗,4℃孵育過夜,用 PBS 洗膜后加入二抗并在室溫下孵育 1 h 后,加入 ECL曝光。

1.2.8體內(nèi)實驗 將裸鼠隨機分為Ctrl組和miR-503-5p mimic組，每組18只，雌雄各半。然后，在各組裸鼠右后肢腹側皮下分別注射 0.2 ml的1×107個/ml膀胱癌細胞T24和轉(zhuǎn)染miR-503-5p mimic的膀胱癌細胞T24懸液。接著，繼續(xù)在SPF條件下正常飲食飼養(yǎng)，觀察裸鼠皮下成瘤情況。第30天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，電子天平稱重。組織一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，一半置于液氮中凍存。

1.2.9免疫組化 膀胱癌細胞T24移植腫瘤組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋切片后，脫蠟水化，過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清阻斷非特異性反應，分別加入鼠抗人Ki67和β-catenin單抗，在4℃下過夜。然后，滴加生物素標記二抗，用DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察統(tǒng)計。

2 結果

2.1預測miR-503-5p的靶向關系 通過基因預測軟件TargetScan和miRanda篩選出bFGF作為miR-503-5p的靶基因，miR-503-5p與bFGF在3′UTR區(qū)存在結合位點(圖1A)。

RT-PCR檢測miR-503-5p的表達結果表明：與Control組相比，mimic-NG組miR-503-5p表達量無明顯變化，miR-503-5p mimic組miR-503-5p表達量顯著上調(diào)，說明mimic-NG對實驗無影響，miR-503-5p mimic轉(zhuǎn)染成功(P<0.01,圖1B)。

RT-PCR檢測bFGF的表達結果表明：與Control組相比，miR-503-5p mimic組bFGF表達量顯著下調(diào)，bFGF組bFGF表達量顯著上調(diào)，說明miR-503-5p mimic對bFGF具有抑制作用，pcDNA-bFGF能使bFGF過表達；mimic+bFGF組bFGF的表達量，和Control組無明顯變化，比miR-503-5p mimic組顯著上調(diào)，比bFGF組顯著下調(diào)，說明miR-503-5p和bFGF具有靶向關系，并且過表達miR-503-5p抑制bFGF表達(P<0.01,圖1C)。

為了進一步驗證miR-503-5p直接作用于bFGF，進行了熒光素酶報告基因?qū)嶒灐＝Y果表明：miR-503-5p對野生型bFGF表達有明顯下調(diào)作用，對突變型沒有明顯作用，提示miR-503-5p直接靶向作用于bFGF(P<0.01,圖1D)。

2.2miR-503-5p過表達抑制膀胱癌細胞T24侵襲 通過Transwell檢測細胞侵襲情況可知：與Control組相比，miR-503-5p mimic組侵襲細胞數(shù)目顯著減少，bFGF組侵襲細胞數(shù)目顯著增多，說明過表達miR-503-5p可以降低膀胱癌細胞T24的侵襲能力，過表達bFGF增強膀胱癌細胞T24侵襲能力；mimic+bFGF組的侵襲細胞數(shù)目，與Control組無顯著差異，比miR-503-5p mimic組顯著增多，比bFGF組顯著降低，這說明過表達miR-503-5p通過抑制bFGF表達進而來抑制膀胱癌細胞T24細胞侵襲(P<0.01,圖2A、B)。

圖1 miR-503-5p靶向作用于bFGFFig.1 miR-503-5p targets to bFGFNote: A.The target genes of miR-503-5p were screened by the gene prediction software TargetScan and miRanda;B.The expression of miR-503-5p was detected by RT-PCR;C.The expression of bFGF was detected by RT-PCR；D.Targeting relationship was detected by luciferase activity;**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus the single transfection group;&&.P<0.01 versus transfected pc-DNA group.

2.3miR-503-5p過表達抑制膀胱癌細胞T24遷移 劃痕實驗結果表明：miR-503-5p mimic組比Control組劃痕寬，閉合率顯著降低，說明過表達miR-503-5p可以抑制膀胱癌細胞T24遷移；bFGF組比Ctrl組細劃痕窄，閉合率顯著升高，說明過表達bFGF可以增強膀胱癌細胞T24遷移能力；mimic+bFGF組劃痕，比Control組劃痕寬、閉合率降低，比miR-503-5p mimic組劃痕窄、閉合率顯著升高，比bFGF組劃痕寬、閉合率降低，這說明過表達miR-503-5p通過抑制bFGF表達來降低膀胱癌細胞T24遷移能力(P<0.01,圖3)。

圖2 Transwell檢測細胞侵襲情況(×400)Fig.2 Detection of cell invasion detected by Transwell(×400)Note: **.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus the single transfection group.

圖3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力Fig.3 Cell migration ability was detected by scratch testNote: **.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus the single transfection group.

圖4 Western blot檢測β-catenin、E-caderin和N-cadherin的表達Fig.4 β-catenin,E-cadherin,N-cadherin expression was detected by Western blotNote: **.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus the single transfection group.

圖5 裸鼠體內(nèi)實驗結果Fig.5 Experimental results in mouseNote: A.Tumor size photo;B.Tumor weight statistics;C.miR-503-5p expression was detected by RT-PCR;D,E.Ki67 and β-catenin were detected by immunohistochemistry;**.P<0.01 versus control group.

2.4miR-503-5p過表達抑制膀胱癌細胞T24上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 通過Western blot檢測β-catenin、E-cadherin和N-cadherin的表達可知：與Control組相比，miR-503-5p mimic組E-cadherin表達顯著上調(diào)，β-catenin和N-cadherin表達顯著下調(diào)，bFGF組E-cadherin表達顯著下調(diào)，β-catenin和 N-cadherin表達顯著上調(diào)，說明過表達miR-503-5p可以抑制膀胱癌細胞T24的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，bFGF促進膀胱癌細胞T24的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；mimic+bFGF組β-catenin,N-cadherin和E-cadherin的表達，與Control組無顯著差異，比miR-503-5p mimic組E-cadherin表達顯著下調(diào)，β-catenin和N-cadherin表達顯著上調(diào)，比bFGF組E-cadherin表達顯著上調(diào)，β-catenin和N-cadherin表達顯著下調(diào)，這說明過表達miR-503-5p通過抑制bFGF表達進而來抑制膀胱癌細胞T24的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.01,圖4)。

2.5裸鼠體內(nèi)實驗 30 d后，檢測腫瘤重量可知：miR-503-5p mimic組與Control組相比，腫瘤重量顯著減輕，說明miR-503-5p過表達可以抑制膀胱癌細胞T24的發(fā)生和發(fā)展(P<0.01，圖5A、B)。

通過RT-PCR檢測miR-503-5p和bFGF的表達發(fā)現(xiàn)：miR-503-5p mimic組與Control組相比，miR-503-5p的表達量顯著上調(diào)，bFGF的表達量顯著下調(diào)，說明miR-503-5p可以使miR-503-5p高表達，抑制bFGF的表達(P<0.01，圖5C)。

通過免疫組化檢測Ki67和β-catenin發(fā)現(xiàn)：與Control組相比，miR-503-5p mimic組Ki67和 β-catenin陽性比率顯著減少，說明過表達miR-503-5p 可以抑制膀胱癌細胞T24細胞增殖和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.01，圖5D、E)。

3 討論

miR-503的表達異常與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關：Jiang等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503表達通過抑制ZNF217表達抑制前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展；Yan等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503通過靶向胰島素樣生長因子1受體，抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲；張等[21]發(fā)現(xiàn)miR-503通過Notch1信號通路對肺癌遷移和侵襲的影響；李小輝等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503-5p通過干擾Rb/E2F信號通路，抑制膀胱癌細胞T24和膀胱癌細胞EJ的增殖。本文通過研究發(fā)現(xiàn)：在結腸癌中，miR-503-5p直接靶向作用于bFGF，并且過表達miR-503-5p抑制bFGF表達，可以抑制結腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

腫瘤細胞的侵襲能力強是癌癥轉(zhuǎn)移且難以根治的主要原因，miR-503的低表達與腫瘤細胞的侵襲是密切相關的。Wu等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503的下調(diào)是胃癌細胞更具有侵襲性；Jiang等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503下調(diào)通過靶向Cyclin D1促進食管鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲；Wang等[13]研究miR-503通過靶向胰島素樣生長因子1受體抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲。本文通過Transwell檢測細胞侵襲情況可知，過表達miR-503-5p通過抑制bFGF表達進而來減弱膀胱癌細胞T24的侵襲能力。

腫瘤細胞遷移速度快是癌癥治療過程中的重要難點，miR-503與腫瘤細胞的遷移是密切相關。Muys等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503過表達降低了JEG-3腫瘤細胞株的侵襲和遷移能力；Wu等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503通過調(diào)節(jié)成纖維細胞生長因子2抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移的作用；Zhang等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503在膠質(zhì)母細胞瘤中過表達不僅通過誘導G0/G1細胞周期阻滯和凋亡來抑制細胞增殖，而且抑制癌細胞侵襲和遷移；本文通過劃痕實驗結果表明過表達miR-503-5p通過抑制bFGF表達來降低膀胱癌細胞T24遷移能力。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是指細胞失去細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，而轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^高遷移與侵襲能力的間質(zhì)表型。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。Zhao等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中miR-503-3p可以直接結合上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關蛋白SMAD2和上皮標記蛋白E-cadherin的mRNA 3′端的未翻譯區(qū)，從而抑制乳腺癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。Peng等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503抑制胃癌細胞生長和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。Guo等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503通過靶向c-myb抑制骨肉瘤的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。本文通過研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-503-5p通過抑制bFGF表達進而來抑制膀胱癌細胞T24的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

通過體外實驗可知，過表達miR-503-5p通過抑制bFGF表達進而來抑制膀胱癌細胞T24的侵襲能力、遷移能力和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。相比單一的外部環(huán)境，生物體內(nèi)環(huán)境是極其復雜多變的，為了更好的了解miR-503對結腸癌的作用，本文進行了裸鼠體內(nèi)實驗。Zhou等[20]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-503通過靶向FGF2和VEGFA的負調(diào)節(jié)來抑制肝癌移植小鼠模型中肝癌細胞的增殖。本文通過裸鼠體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-503-5p 通過抑制bFGF表達抑制膀胱癌細胞T24細胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制膀胱癌細胞T24的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，無論是在體外還是體內(nèi)，過表達miR-503-5p 通過靶向抑制bFGF表達抑制膀胱癌細胞T24細胞的侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制膀胱癌細胞T24的發(fā)生和發(fā)展。這為膀胱癌的治療和診斷提供新的思路，為miR-503-5p作為膀胱癌基因治療的靶點提供參考數(shù)據(jù)。