李淑艷 吳艷敏 劉 睿 張春晶 姚淑娟 衣同輝 師 巖

(齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術學院，齊齊哈爾161006)

內(nèi)皮抑素(Endostatin,ES)是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，其在抑制腫瘤形成和轉(zhuǎn)移，促使腫瘤細胞凋亡等方面具有重要的研究價值。內(nèi)皮抑素由184個氨基酸殘基組成，通過特異性抑制內(nèi)皮細胞增殖和血管生成達到抑制腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[1,2]。2005年，Robert等[3]證明內(nèi)皮抑素活性區(qū)主要在N端的1～27位氨基酸上[3]。在前期工作中，本課題組截取1～27位氨基酸，并通過RGDRGD靶向連接改造形成人內(nèi)皮抑素30肽(以下簡稱30肽)，研究表明，30肽可以更有效地殺傷腫瘤細胞，對肝癌細胞的侵襲、遷移和黏附等過程都具有較好的抑制效果[4,5]。但30肽對細胞凋亡相關信號通路的研究至今尚未明確報道，本文擬在前期工作基礎上，研究30肽對肝癌細胞凋亡作用的影響，同時對凋亡相關蛋白和信號通路進行初步研究。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細胞株Bel-7402購自中科院細胞庫，30肽按以往文獻報道方法制備[6]。胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM-H培養(yǎng)基購自Gibco公司。CCK-8試劑盒購自南京碧云天生物技術公司，Muse Annexin V Dead Cell Kit購自默克密理博公司，Hoechst33342熒光染料購自北京索萊寶生物科技有限公司。GADPH單抗、FoxM1單抗、MMP-2單抗和MMP-9單抗購自美國Santa Cruz公司，Caspase-3和Caspase-9活性測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.130肽對肝癌細胞株Bel-7402增殖抑制效果的測定 Bel-7402細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%以上時用0.25%胰酶消化，用10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液后，按照0.5×104個/孔的密度將細胞接種于96孔板中，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)。將肝癌細胞株Bel-7402分為6組：對照組(0 μg/ml)、30肽組(終濃度分別為20、40、60、80和100 μg/ml，每組設置8個復孔)。培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的30肽，對照組加入相同體積培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用CCK-8試劑盒測定細胞存活率。按照試劑盒說明20 μl/孔加入CCK-8檢測試劑，孵育3.5 h后在450 nm測定吸光度，以650 nm作為參考波長。通過計算細胞存活率來測定30肽對肝癌細胞株Bel-7402的半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.2Hoechst33342染色檢測肝癌細胞株Bel-7402凋亡的形態(tài)學變化 取處于對數(shù)生長期的Bel-7402細胞，用0.25%胰酶消化后按1×106個/孔接種于6孔板中，待培養(yǎng)貼壁后，分組及30肽處理濃度同1.2.1。細胞培養(yǎng)24 h后，PBS溶液洗滌2次，加入4%甲醛溶液于-20℃固定25 min，取出后PBS溶液洗滌2次并晾干后，加入Hoechst33342染色10 min，PBS溶液洗滌3次后以340 nm波長激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3流式細胞術檢測30肽對肝癌細胞株Bel-7402凋亡的影響 按照肝癌細胞株Bel-7402凋亡形態(tài)學實驗中所述方法進行細胞培養(yǎng)和收集。將細胞用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按50 μl/孔重懸。按照Muse Annexin V Dead Cell Kit檢測試劑盒的操作流程進行染色，最后使用Muse細胞分析儀進行樣品檢測。按照試劑盒說明將雙參數(shù)散點圖進行分相分析，以獲得各實驗組中正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞的比例。

1.2.430肽對FoxM1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 根據(jù)IC50測定結果，將終濃度為43.07 μg/ml的30肽加入到鋪滿Bel-7402細胞的6孔板中，分別于0 h、12 h、24 h和36 h收集各組的細胞并加入預冷的細胞裂解液。裂解后收集細胞裂解液以12 000 g，4℃離心10 min，取上清液進行檢測。首先應用DC Protein Assay Kit進行樣品蛋白質(zhì)濃度測定后，將提取物按30 μg/孔進行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉液中室溫封閉1.5 h，加入相應稀釋倍數(shù)的一抗，孵育過夜，洗膜后，加入1∶5 000的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育3 h，曝光膠片后用Image J軟件進行分析。

1.2.530肽對Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響 按實驗方法1.2.4，將終濃度為43.07 μg/ml的30肽加入到鋪滿Bel-7402細胞的6孔板中，分別于0 h、12 h、24 h和36 h收集各組的細胞并加入預冷的細胞裂解液收集蛋白，取50 μg全細胞裂解液蛋白，按試劑盒說明書要求分別加入25 μmol/L Caspases-3底物(DEVD-pNA)和Caspase-9底物(IETD-pNA)，37℃下孵育2 h后，使用酶標儀測定405 nm吸光度。

2 結果

2.130肽對肝癌細胞株Bel-7402增殖的抑制作用 CCK-8檢測試劑含有WST-8，在細胞線粒體脫氫酶作用下生成黃色可溶于水的化合物formazan。生成的formazan數(shù)量與存活細胞數(shù)量呈正比。通過酶標儀測定表明30肽能抑制Bel-7402細胞的增殖，并呈劑量依賴性。應用線性回歸分析計算出30肽對Bel-7402細胞的半數(shù)抑制濃度IC50為43.07 μg/ml。見圖1。

2.2Hoechst33342染色檢測30肽作用后Bel-7402細胞的形態(tài)學變化 Bel-7402細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后在倒置顯微鏡下觀察，可見對照組細胞數(shù)量較多，細胞間連接緊密，Hoechst33342染色后觀察可見細胞核大小均一。不同濃度的30肽(0、20、40、60、80、和100 μg/ml)作用于Bel-7402細胞24 h后，隨著30肽濃度的增加，各組細胞數(shù)量逐漸減少，細胞邊界收縮變圓，細胞核大小不一，出現(xiàn)核內(nèi)部分染色質(zhì)斷裂、皺縮，形成團塊現(xiàn)象。見圖2。

圖1 內(nèi)皮抑素30肽對Bel-7402細胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of endostatin peptide 30 on proliferation of Bel-7402 cells

2.3流式細胞術檢測Bel-7402細胞凋亡率 收集各濃度30肽(0、20、40、60、80和100 μg/ml)作用24 h后的Bel-7402細胞進行流式細胞術檢測。0 μg/ml 組為對照組，結果表明：從20 μg/ml開始，30肽就對Bel-7402細胞產(chǎn)生了明顯的殺傷作用，細胞凋亡率依次為：0%、(18.40±2.0)%、(37.66±2.5)%、(69.22±2.0)%、(72.76±2.1)%、(86.84±2.3)%，可見，隨著30肽濃度的增高，細胞存活數(shù)量逐漸減少，凋亡數(shù)量逐漸增加，呈劑量依賴性，趨勢和Hoechst33342染色結果一致。各處理組凋亡率與對照組(0 μg/ml組)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖2 30肽作用24 h后Bel-7402細胞的形態(tài)學改變和Hoechst33342染色結果(×400)Fig.2 Morphological changes and Hoechst33342 staining results of Bel-7402 cells 24 h after peptide 30 treatment(×400)Note:In each group,the left side is observed under an inverted microscope,and the right side is the staining result of Hoechst33342.

2.430肽對FoxM1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 結果如圖4、表1所示：根據(jù)IC50測定結果，將終濃度為43.07 μg/ml的30肽作用于Bel-7402細胞后， FoxM1、 MMP-2和MMP-9蛋白表達量隨作用時間的延長而下調(diào)。當作用時間達到24 h后，30肽作用組和對照組(0 h組)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 不同濃度30肽作用Bel-7402細胞24 h后的流式細胞術檢測結果Fig.3 Flow cytometry results of Bel-7402 cells treated with peptide 30 at different concentrations for 24 h

圖4 30肽對Bel-7402細胞FoxM1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響Fig.4 Effect of peptide 30 on expression of FoxM1,MMP-2 and MMP-9 in Bel-7402 cells

Gray intensity ratioTime0 h12 h24 h36 hFoxM1/GAPDH4.40±0.213.24±0.862.30±0.541)2.24±0.741)MMP-2/GAPDH1.63±0.421.14±0.540.68±0.391)0.58±0.421)MMP-9/GAPDH1.24±0.170.86±0.190.72±0.191)0.67±0.161)

Note：1)P<0.05 vs 0 h group.

GroupsCaspase-312 h24 h36 hCaspase-912 h24 h36 hPeptide 301.06±0.081)1.21±0.121)1.35±0.091)1.12±0.081)1.43±0.111)1.63±0.031)Control0.43±0.110.41±0.070.39±0.050.51±0.020.52±0.070.46±0.01

Note：1)P<0.05 vs control group.

2.530肽對Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響 測定405 nm的吸光度，對Caspase-3和Caspase-9酶活性進行分析。實驗結果表明：隨著時間的延長，30肽作用后各組Caspase-3和Caspase-9酶活性增高，與對照組(0 h組)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見表2。

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一[7,8]，其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢[9]。目前對于肝癌的治療主要以傳統(tǒng)的放療和化療為主，但由于肝癌細胞對大多數(shù)的放化療藥物不敏感，導致傳統(tǒng)療法收效甚微[10]。因此，尋找新的高效低毒的小分子肽是臨床上治療肝癌的關鍵。

內(nèi)皮抑素30肽是通過基因工程技術對內(nèi)皮抑素改構修飾形成的小分子肽，能顯著抑制腫瘤組織新生血管的生成，抑制腫瘤細胞的生長與增殖，還能通過與整合素結合發(fā)揮去整合素效應，進而有效地抑制腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[4]。

本研究中，內(nèi)皮抑素30肽能夠顯著抑制人肝癌Bel-7402細胞的活力，作用24 h抑制作用最明顯，半數(shù)抑制濃度IC50為43.07 μg/ml，并且呈劑量依賴性。

定性實驗：Hoechst33342染色實驗檢測30肽作用后Bel-7402細胞的形態(tài)學變化，發(fā)現(xiàn)不同濃度的30肽作用于Bel-7402細胞后，隨著30肽濃度的增加，各組細胞數(shù)量逐漸減少，細胞邊界收縮變圓，細胞核大小不一，出現(xiàn)核內(nèi)部分染色質(zhì)斷裂、皺縮，形成團塊現(xiàn)象。定量實驗：流式細胞術檢測30肽對Bel-7402凋亡率，發(fā)現(xiàn)30肽作用組細胞凋亡率逐漸增加，呈劑量依賴性。因此，本研究通過Hoechst33342染色和流式細胞術檢測，確定了30肽可以有效促進肝癌Bel-7402細胞凋亡。

叉頭框蛋白M1(Forkhead box M1，F(xiàn)oxM1)于2007年首次被發(fā)現(xiàn)，屬于Fox轉(zhuǎn)錄因子家族[11]。FoxM1在胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肝癌等多種人類癌癥細胞中過量表達，與癌癥晚期、癌細胞轉(zhuǎn)移、高增殖、化療耐藥性以及預后不良等密切相關，還參與多種癌癥相關基因的表達及信號轉(zhuǎn)導途徑。因此，F(xiàn)oxM1被認為是抗癌藥物治療與干預的重要藥靶與標記，在腫瘤組織的增殖、凋亡以及器官發(fā)育等多方面具有重要作用[12,13]。Marianna等[14]研究報道，靶向FoxM1的多肽可以有效促進腫瘤細胞凋亡[15]。相對于腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導通路而言，F(xiàn)oxM1基因可能是通過GRB7/ERK/FOXM1等信號通路影響細胞凋亡，并且在此信號通路激活過程中，活化的ERK使AP-1蛋白磷酸化，最終使MMP-2、MMP-9的表達量上升[16]；活化的FOXM1也可以使細胞中MMP-2、MMP-9指標升高[17]。

本研究中，30肽作用組FoxM1、MMP-2和MMP-9蛋白表達量隨30肽作用時間的延長而下調(diào)，表明30肽可能是通過GRB7/ERK/FOXM1信號通路抑制FoxM1基因表達，進而抑制下游MMP-2和MMP-9表達，誘導肝癌細胞Bel-7402凋亡。

Caspase蛋白酶家族在細胞凋亡中起到重要作用。其中Caspase-3、Caspase-9的激活與細胞的線粒體通路凋亡密切相關[18]，本研究測定了30肽對Bel-7402細胞Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響，結果表明，隨著30肽作用時間的延長，各組Caspase-3和Caspase-9酶活性均明顯增高，可以確定線粒體通路在30肽誘導肝癌Bel-7402細胞凋亡中也具有重要意義。

綜上所述，30肽能有效抑制肝癌Bel-7402細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡。其機制與30肽抑制FoxM1、MMP-2和MMP-9基因表達，激活Caspase-3、Caspase-9酶活性有關。本研究進一步闡明了30肽抗腫瘤的分子機制，為30肽應用于肝癌的治療提供了新的實驗依據(jù)，為臨床抗腫瘤多肽生物技術藥物的研發(fā)提供了新的線索。