王一唯 黃 婷 孫 笑 王玉東

(上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院，上海200030)

子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖惡性腫瘤之一，占婦科惡性腫瘤的20%～30%[1]。在2015年，中國約有63 400例子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例和21800例死亡病例[2]。子宮內(nèi)膜癌進展是一個多因素調(diào)控的復雜過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)作用于其受體RANK后能促進子宮內(nèi)膜癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，并促使組織蛋白酶S(Cathepsin S，CTSS)高表達[3]。有報道發(fā)現(xiàn)免疫細胞在子宮內(nèi)膜癌的進展過程中發(fā)揮了重要作用[4]，且CTSS能在膀胱癌等多種癌癥中通過AKT信號途徑募集調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)干擾腫瘤的侵襲過程[5]。浸潤于腫瘤的Treg細胞主要通過細胞間直接接觸(Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4)和分泌抑制性細胞因子(IL-10和TGF-β)這兩種方式來發(fā)揮其免疫抑制功能[6]。但Treg細胞參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌進展的研究少有報道。因此，本課題嘗試研究子宮內(nèi)膜癌中RANKL與Treg細胞之間的調(diào)控關(guān)系，從而為子宮內(nèi)膜癌的免疫治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 研究共納入2013年至2019年本院經(jīng)手術(shù)后病理證實的44例子宮內(nèi)膜癌患者。子宮內(nèi)膜癌按照FIGO(The International Federation of Gynecology and Obstetrics)分期標準Ⅰ期31例，Ⅱ期7例[7]。其中，石蠟標本來自于2013年至2017年的32例子宮內(nèi)膜癌患者。血清標本來自于2017年至2019年的12例內(nèi)膜癌患者。同期納入15例因子宮肌瘤行子宮切除的正常內(nèi)膜組織和8例正常人的血清樣本作為對照組。樣本收集經(jīng)過上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院科研倫理委員會批準，并獲得患者知情同意。

1.1.2實驗材料 主要試劑包括Hec-1B細胞(中科院細胞庫)，外周單個核細胞(美國ALLCELLS公司)，RANK慢病毒(上海和元生物科技公司)，重組人TGF-β，重組人RANKL(美國Peprotech公司)，人RANKL ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司),人CTSS 酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，CTSS(臺灣Genetex公司)，RANKL、Foxp3、GAPDH抗體(美國Abcam公司)，p-AKT、AKT、p-mTORC、mTORC抗體(美國CST公司)，LEAFTM-purified anti-human CD3(OKT3)、LEAFTM-purified anti-human CD28 (CD28.2)、重組人TGF-β、FITC標記的CD4抗體、PE標記的CD25抗體(美國eBioscience公司)，SDS-PAGE試劑(上海生工生物工程股份有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)，青鏈霉素(美國Sigma公司)，人初始CD4+分選盒(美國Stemcell公司)。主要設備包括流式細胞儀(BD公司)，Bio-Rad電泳儀，Bio-Rad Western blot化學發(fā)光成像系統(tǒng)，分光光度儀(Beckman公司)，倒置顯微鏡(Leica公司)。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 將子宮內(nèi)膜癌及正常內(nèi)膜組織的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液高壓鍋抗原熱修復，用10%牛血清封閉，分別加入RANKL抗體(1∶200)、CTSS抗體(1∶200)和GAPDH抗體(1∶400)后4℃過夜。加相應二抗(1∶1 000)37℃孵育60 min。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。每張切片40倍鏡隨機選取5個視野觀察，計數(shù)著色陽性的細胞百分比，結(jié)果取平均值。對組織切片的評價采用半定量的H評分(H-score)分析[8]。H評分=陽性細胞百分比×著色強度分級。無著色為0分，出現(xiàn)較淺的陽性染色為1分，出現(xiàn)中等的陽性染色為2分，出現(xiàn)強陽性染色為3分。

1.2.2Treg細胞分離和培養(yǎng) 取人外周血單個核細胞，加入初始CD4+分選抗體孵育5 min，加入磁珠孵育5 min。樣品管置于磁鐵上分選。取上清，離心1 000 r/min，5 min。將細胞鋪于CD3抗體(1 mg/ml)和CD28抗體(1 mg/ml)包被的24孔板上，加入TGF-β(5 μg/L)刺激，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。取出離心后于1×106細胞中分別加入FITC標記的CD4抗體(1∶400)和PE標記的CD25抗體(1∶400)染色30 min。每個樣品設置同型對照。樣品管至于流式細胞儀上檢測。

1.2.3慢病毒干擾實驗 慢病毒載體為pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA。腫瘤細胞培養(yǎng)至70%密度時，加入慢病毒和polybrene試劑(5 μg/L)培養(yǎng)。12 h后觀察細胞狀態(tài)，更換培養(yǎng)基并使用嘌呤霉素篩選2周。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附實驗 將患者和對照組外周血血清和標準品稀釋后加入包被RANKL抗體的96孔板，固定，37℃孵育60 min，加二抗孵育60 min。加入顯色劑顯色，酶標儀上讀取A405 吸收值。

1.2.5Western blot 將RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑)加入經(jīng)過外源性RANKL刺激(1 μg/ml)和對照處理的Hec-1B細胞組，提取總蛋白，測定蛋白濃度。配置10%的下層膠和5%的濃縮膠，上樣蛋白進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至NC膜。經(jīng)5%牛血清蛋白封閉后，分別加入CTSS(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、p-mTORC(1∶1 000)抗體后4℃過夜。加相應二抗(1∶10 000)37℃孵育60 min。加入ECL顯色劑顯色。

1.2.6Transwell實驗 將一定量的Hec-1B細胞或者Treg細胞消化離心，計數(shù)，均勻接種至Transwell上室底部，再將小室放入加了Treg細胞培養(yǎng)液(Hec-1B侵襲)和Hec-1BshRANK及對照組(Treg細胞趨化)的24孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)Hec-1B細胞24 h(Treg細胞6 h)后，取出小室，PBS清洗3次，用多聚甲醛對小室底部背面穿過的細胞進行固定。使用結(jié)晶紫對其進行染色，鏡檢計數(shù)(免疫細胞離心并計數(shù))并分析作圖。

1.3統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0和Graphpad Prism 7.0進行分析和作圖，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1患者的血清及組織中RANKL和CTSS表達水平分析 免疫組化的結(jié)果提示，子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤組織中的RANK和CTSS表達水平均高于對照組(P<0.001)，見圖1A、B。如圖1C示，ELISA結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌患者的血清RANKL水平(62.45 ± 5.18)pg/ml高于對照組(9.667±1.202)pg/ml，P=0.002。

2.2患者的血清及組織Treg細胞數(shù)量分析 免疫組化的結(jié)果顯示，如圖2A所示，子宮內(nèi)膜癌患者組織中浸潤的Treg細胞明顯多于正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞術(shù)的結(jié)果提示，子宮內(nèi)膜癌患者外周血中Treg細胞比例(8.94±0.97)%高于對照組(6.15±1.26)%，P<0.05，見圖2B。

2.3RANKL對CTSS表達的調(diào)控作用 Western blot結(jié)果顯示，加入外源性RANKL(1 μg/ml)能上調(diào)Hec-1B中的CTSS蛋白水平(P<0.05)，見圖3A、B。同時，將干擾RANK表達的Hec-1B與Treg細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Hec-1BshRANK能明顯抑制CTSS引起的Treg細胞浸潤(P<0.01)，見圖3C。

2.4Treg細胞浸潤對子宮內(nèi)膜癌侵襲的影響 從圖4可見，Transwell實驗的結(jié)果顯示，加入Treg細胞培養(yǎng)上清后小室下室的Hec-1B細胞數(shù)明顯增加，實驗組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5RANKL對AKT/mTORC信號通路的影響 Western blot結(jié)果顯示，給予外源性RANKL后，AKT和mTORC的磷酸化水平相較于對照組明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖1 血清及組織RANKL和CTSS的表達Fig.1 Expression of RANKL and CTSS in serum and tissueNote: A.Expression of RANKL and CTSS in endometrium; B.Bar charts of RANKL and CTSS；C.Expression of RANKL in serum.Scale bars=50 μm.**.P<0.01.

圖2 血清及組織Treg細胞的表達Fig.2 Expression of Tregs in serum and tissueNote: A.Expression of Foxp3 in endometrium; B.Amount of Treg in serum.*.P<0.05.

圖3 RANKL對CTSS的表達調(diào)控及其募集Treg細胞能力Fig.3 Effects of RANKL on modulating CTSS and recruiting TregsNote: A.Expression of CTSS and GAPDH after stimulating with RANKL; B.Bar charts of CTSS; C.Amount of Tregs after interfering RANK.*.P<0.05.**.P<0.01.

圖4 Treg細胞對子宮內(nèi)膜癌侵襲能力的影響Fig.4 Effect of Treg on capacity of invasionNote: A.Amount of Hec-1B after culturing with Treg supernatant; B.Bar charts of Hec-1B.**.P<0.01.Scale bars.50 μm.

圖5 RANKL對p-AKT及p-mTORC的表達調(diào)控Fig.5 Effects of RANKL on modulation of p-AKT and p-mTORCNote: A.Expression of p-AKT and p-mTORC after stimulating RANKL; B.Bar charts of p-AKT and p-mTORC.*.P<0.05;**.P<0.01.

3 討論

本次研究的目的是分析子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤組織中RANKL的表達水平，并探討其對子宮內(nèi)膜癌侵襲功能的影響。RANKL基因位于13號染色體上，屬Ⅱ型跨膜蛋白,在體內(nèi)以膜結(jié)合型和可溶性羧基末端兩種形式存在[9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，RANKL動員多種免疫細胞，參與一些自身免疫疾病的進展[10,11]。在乳腺癌中，RANKL能在孕激素的調(diào)控下影響AKT/mTORC通路，從而介導腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[12,13]。我們之前的研究已經(jīng)證實，內(nèi)膜癌細胞株受到RANKL刺激后能上調(diào)N-cadherin和下調(diào)E-cadherin的表達從而促進子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移[4]。本研究結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜癌患者血清和腫瘤組織中的RANKL蛋白水平均顯著高于對照者。同時，共培養(yǎng)實驗證明，RANKL能促進Treg細胞的聚集，從而增強了子宮內(nèi)膜癌的侵襲能力，提示RANKL在子宮內(nèi)膜癌進展過程中起著重要作用。

之前的研究認為RANKL能促進巨噬細胞向Ⅱ型(免疫抑制型)轉(zhuǎn)化，從而促進腫瘤局部形成免疫抑制狀態(tài)。這也與本次研究的結(jié)果相符。我們發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者中腫瘤組織CTSS表達水平高于對照組。干擾RANK表達能明顯抑制CTSS的蛋白水平，并且能抑制Treg細胞的聚集。CTSS是一種半胱氨酸蛋白酶，具有肽鏈內(nèi)切酶活性[14]。研究表明，CTSS可影響免疫細胞MHCⅡ抗原呈遞，并且能水解抗原表位造成免疫逃逸[15]。這些結(jié)果提示了CTSS在RANKL募集Treg細胞促進子宮內(nèi)膜癌遷移中可能發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)，RANKL募集Treg細胞之后可增強子宮內(nèi)膜癌的侵襲功能。其作用機制可能是通過促進AKT和mTORC的磷酸化，影響CTSS的表達。本研究初步探討了子宮內(nèi)膜癌中Treg細胞的影響，將為子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療提供了潛在靶點。