王子涵，錢(qián)籽霖，向敏，徐茂，蔣和體

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

拐棗，學(xué)名枳椇(Hoveniadulcis)，可食部分是其膨大彎曲、形似雞爪的果梗部分(副果，本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象)，而并非堅(jiān)硬的種子(枳椇子),原產(chǎn)于東亞地區(qū)，特別是在中國(guó)、日本、韓國(guó)，有著悠久的食用和藥用歷史，是一種可安全食用和開(kāi)發(fā)利用的果實(shí)[1-2]。研究表明，拐棗果梗含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，糖類(lèi)、有機(jī)酸、維生素，以及生物活性多糖、生物堿、酚類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、緩解酒精中毒、解酒保肝等功效[3-4]。中醫(yī)則認(rèn)為拐棗果梗具有健胃、滋養(yǎng)補(bǔ)血等功效[5]。國(guó)內(nèi)目前多以研究拐棗醋、拐棗酒等產(chǎn)品為主，或是研究拐棗提取物如拐棗多糖、多酚提取物的抗氧化活性為主，少有研究拐棗及其制品的抗氧化活性及其他功能特性，關(guān)于乳酸菌發(fā)酵拐棗汁及其抗氧化、抗衰老功效的相關(guān)研究也甚少。

乳酸菌是指一類(lèi)能發(fā)酵糖類(lèi)并產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[6]，不僅能增加果蔬汁中有機(jī)酸、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的含量，還能促進(jìn)某些營(yíng)養(yǎng)成分，如某些礦物質(zhì)的吸收，同時(shí)能分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸，相比于普通果蔬汁，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的營(yíng)養(yǎng)更為豐富和完整[7-9]。而果蔬乳酸菌發(fā)酵汁一般有活菌型(即未殺滅乳酸菌)和滅菌型(即殺滅乳酸菌)2種，本文利用乳酸菌發(fā)酵工藝對(duì)拐棗汁進(jìn)行發(fā)酵，制成活菌型和滅菌型2種發(fā)酵汁，通過(guò)對(duì)比其與原汁的不同自由基清除率，來(lái)評(píng)價(jià)乳酸菌發(fā)酵拐棗汁的體外抗氧化活性，同時(shí)選取果蠅作為體內(nèi)試驗(yàn)生物，探究活菌型及滅菌型發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅壽命是否有延長(zhǎng)作用，以及對(duì)果蠅體內(nèi)超氧化物岐化酶(superoncide dismutase，SOD)活力、總抗氧化活力(total antio xisant capacity，T-AOC)活力、丙二醛(malondicaldehyde，MDA)含量的影響，以此評(píng)價(jià)發(fā)酵拐棗汁延緩衰老的功能及體內(nèi)抗氧化活性，以期為發(fā)酵拐棗汁的利用、拐棗保健新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

拐棗：購(gòu)自陜西省安康旬陽(yáng)縣拐棗基地， 4℃冷藏備用；果膠酶：諾維信生物技術(shù)有限公司，活性5 000 U/mg；干酪乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、酵母菌1383：中國(guó)微生物菌種保藏中心；野生型黑腹果蠅：由西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物遺傳學(xué)教研室供給；二苯基苦肼基自由基(DPPH)：美國(guó)Sigma公司；SOD試劑盒、T-AOC試劑盒、MDA試劑盒：南京建成生物有限公司；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純：成都市科龍華工試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1數(shù)顯糖度儀，上海上天緊密儀器有限公司；WFJ7200可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HDL-4臺(tái)式離心機(jī)，常州市鴻科儀器廠(chǎng)；VD-650超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；4K-15冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵拐棗汁制備工藝

1.3.1.1 拐棗汁工藝流程

新鮮拐棗去籽清洗瀝干水分，按照料水比(g∶g)1∶1打漿，于微波爐中火滅酶3～5 min，當(dāng)物料中心溫度達(dá)到80～85℃時(shí)停止滅酶。冷卻至室溫后酶解2次，果膠酶添加量0.11%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間2 h。酶解液用100目細(xì)紗布過(guò)濾，灌裝于馬口鐵罐中，85℃下殺菌30 min，快速冷卻后得到拐棗汁，4℃冷藏備用。

1.3.1.2 滅菌型乳酸菌發(fā)酵拐棗汁工藝流程

取拐棗汁按照m(干酪乳桿菌)∶m(短乳桿菌)∶m(腸膜明串珠菌)∶m(果酒酵母1383)=2∶2∶2∶1的復(fù)配比例進(jìn)行接種，接種量為10%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時(shí)間41 h。發(fā)酵終止后將發(fā)酵拐棗汁4 500 r/min條件下離心15 min，過(guò)濾并灌裝于耐熱PET瓶，85℃下滅菌15 min，得到滅菌型發(fā)酵拐棗汁。

1.3.1.3 活菌型乳酸菌發(fā)酵拐棗汁工藝流程

取發(fā)酵拐棗汁，離心過(guò)濾后無(wú)菌條件下灌裝于PET瓶，即得到活菌型發(fā)酵拐棗汁，4℃冷藏備用。

1.3.2 果蠅培養(yǎng)基的制備

1.3.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

在A(yíng)杯中加入450 mL蒸餾水，在水溫90℃左右時(shí)加入72 g葡萄糖，6 g瓊脂粉，邊緩慢加入邊攪拌，煮沸至溶解。在B杯中加入300 mL蒸餾水，72 g玉米粉，攪拌后緩慢加入A杯，待A杯煮沸至黏稠狀，?；鹄鋮s2 min左右至80℃，加入10 g酵母粉，6 mL丙酸，攪拌均勻。趁熱分裝到培養(yǎng)指管中，室溫放置到凝固后再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中備用。

1.3.2.2 樣品培養(yǎng)基

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加發(fā)酵拐棗汁溶液，分別配制濃度梯度為 5、10、15 g/L的低中高3組劑量的培養(yǎng)基，攪拌均勻后立即分裝到培養(yǎng)指管中，室溫放置到凝固后再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中備用。

1.3.3 體外抗氧化活性的測(cè)定

DPPH自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10-11]；OH自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]；ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[11，13]；超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[14-15]。

1.3.4 發(fā)酵拐棗汁果蠅壽命的測(cè)定

參考文獻(xiàn)計(jì)算果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命、最高壽命、壽命延長(zhǎng)率和存活率，并繪制生存曲線(xiàn)，以每組最后10只果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)作為最高壽命。

半數(shù)死亡時(shí)間(median lethal time，LT50)如公式(1)所示:

LT50/d=第50只果蠅死亡時(shí)間(n=100)

(1)

平均壽命(mean life-span，MLS)如公式(2)所示：

(2)

式中：xi，第i次記錄時(shí)的果蠅死亡數(shù)；di，第i次記錄時(shí)死亡果蠅的存活天數(shù)；n，果蠅總數(shù)，100。

平均最高壽命(maximum mean life-span, MMLS)如公式(3)所示：

(3)

式中：xi′，第i次記錄時(shí)最后10只果蠅的死亡數(shù)；di′，第i次記錄時(shí)最后10只果蠅中死亡果蠅的存活天數(shù)；n′，最后存活的10%果蠅總數(shù)，10。

壽命延長(zhǎng)率如公式(4)所示：

(4)

式中：x1，實(shí)驗(yàn)組果蠅平均壽命；x0，空白組果蠅平均壽命。

存活率如公式(5)所示：

(5)

式中:xi，第i次記錄時(shí)存活果蠅的數(shù)量；n，果蠅總數(shù)，100。

1.3.5 果蠅體內(nèi)SOD活力、總抗氧化T-AOC活力、丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

分別收集1 600只羽化1 d內(nèi)未交配的雌雄果蠅，隨機(jī)分為4個(gè)濃度梯度組(0、5、10、15 g/L)，每組雌雄果蠅各10管，每管40只，每4 d更換1次培養(yǎng)基，于第20、40天時(shí)麻醉雌雄果蠅各5管。稱(chēng)取全部果蠅，用生理鹽水(1∶49，g ∶mL)制成20 g/L的組織勻漿，在冰浴條件下用玻璃勻漿器制備勻漿。于4℃，2 500 r/min離心15 min，收集上清液，根據(jù)試劑盒按步驟測(cè)定每組果蠅組織上清液中總SOD活性、總抗氧化能力T-AOC及MDA含量，單位分別為：U/mg蛋白、L/mg蛋白和nmol/mg蛋白，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.6 果蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[16-17]。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：y=6.596 5x+0.047 6，R2=0.985 6。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及計(jì)算， SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析， Origin 8.1進(jìn)行作圖。取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵拐棗汁的體外抗氧化活性

如圖1所示，4種清除率與拐棗汁濃度存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著拐棗汁濃度的增加，自由基清除率也隨之升高。當(dāng)稀釋質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)，活菌型、滅菌型及未發(fā)酵汁的DPPH自由基清除率最大，分別為95.01%、94.36%、91.69%。同時(shí)羥基自由基清除率也達(dá)到最大，分別為：92.23%、81.55%、92.23%。在測(cè)定范圍內(nèi)，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率最高均達(dá)98%以上，與原汁無(wú)顯著性差異；當(dāng)稀釋質(zhì)量濃度為0.2 g/L 時(shí)，超氧陰離子自由基清除率最大，活菌型、滅菌型及未發(fā)酵汁分別為：63.65%、63.65%、70.26%。總體說(shuō)明發(fā)酵拐棗汁具有較強(qiáng)的抗氧化活性，這可能與發(fā)酵拐棗汁中的總酚、黃酮、多糖等活性物質(zhì)的存在有關(guān)。

a-DPPH·清除率；b-·OH清除率；c-ABTS+·清除率；清除率圖1 發(fā)酵拐棗汁對(duì)不同自由基的清除能力Fig.1 The ability of fermented hovenia dulcis juice to clear different free radicals

2.2 發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅壽命的影響

果蠅常被作為衰老試驗(yàn)(生存試驗(yàn))的動(dòng)物模型，果蠅生存試驗(yàn)是判斷保健食品是否具有延緩衰老作用的常用檢測(cè)方法之一[18]。由表1可知，滅菌型及活菌型發(fā)酵拐棗汁飼喂雌雄果蠅的LT50、MLS及MMLS均顯著高于CK組(P<0.01或0.05)，且壽命隨著發(fā)酵拐棗汁濃度的增加而不斷延長(zhǎng)，即存在濃度依賴(lài)關(guān)系，可見(jiàn)發(fā)酵拐棗汁具有顯著延長(zhǎng)果蠅壽命的作用。其中，活菌型發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅的延壽效果明顯強(qiáng)于滅菌型發(fā)酵拐棗汁，可能是由于活菌型發(fā)酵拐棗汁中含有更高的抗氧化、抗衰老等生物活性物質(zhì)。以活菌型發(fā)酵拐棗汁為例，隨著濃度的增加，雄果蠅的LT50依次延長(zhǎng)了9、23、31 d，雌果蠅的LT50依次延長(zhǎng)了6、14、22 d；雄果蠅的MLS依次延長(zhǎng)了7.39、18.82、27.62 d，延長(zhǎng)率依次為17.79%、45.31%、66.49%，雌果蠅的MLS依次延長(zhǎng)了5.07、12.45、20.74 d，延長(zhǎng)率依次為14.95%、36.71%、61.16%。此外，由于雌雄果蠅對(duì)受試物的敏感性不同[19]，造成了發(fā)酵拐棗汁對(duì)雌雄果蠅的影響效果不同；雄果蠅的MMLS依次延長(zhǎng)了8.10、20.30、28.80 d，雌果蠅的MMLS依次延長(zhǎng)了6.90、17.80、25.70 d，最高壽命能反映發(fā)酵拐棗汁對(duì)體質(zhì)強(qiáng)壯果蠅的延壽效果及果蠅對(duì)活性物質(zhì)的適應(yīng)性及耐受性[20]，可見(jiàn)雌雄果蠅對(duì)發(fā)酵拐棗汁的適應(yīng)及耐受性也有所差異。

圖2所示為不同劑量組飼喂果蠅的生命周期變化。各組隨著飼喂劑量的增加，雌雄果蠅的存活率均不斷增大，存活時(shí)間均不斷增長(zhǎng)，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，飼喂發(fā)酵拐棗汁的果蠅存活率均明顯高于對(duì)照組。在飼喂前24 d，由于果蠅處于青年生長(zhǎng)期，因此各劑量組果蠅存活率均較高，死亡較為緩慢，各劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。隨后逐漸進(jìn)入衰老死亡期，存活率也加速降低，死亡速度逐漸加快。

綜合表1及圖2，可知乳酸菌發(fā)酵拐棗汁能顯著延緩雌雄果蠅的衰老周期，提高果蠅的存活率，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，當(dāng)飼喂發(fā)酵拐棗汁質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，延壽效果最好。

表1 不同劑量發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅壽命的影響Table 1 Effects of different doses of fermented hovenia dulcis fruit pedicel juice on the lifespan of D. melanogaster

注：*表示各劑量組與CK組相比差異顯著，P<0.05；**表示各劑量組與CK組相比差異極顯著，P<0.01。下同。

a-滅菌型飼養(yǎng)的雌果蠅存活率;b-滅菌型飼養(yǎng)的雄果蠅存活率;c-活菌型飼養(yǎng)的雌果蠅存活率;d-活菌型飼養(yǎng)的雄果蠅存活率圖2 不同劑量發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅存活率的影響Fig.2 Effects of different doses of fermented hovenia dulcis fruit pedicel juice on the survival rate of D. melanogaster

2.3 發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅體內(nèi)T-SOD酶活力的影響

由表2可知，隨著發(fā)酵拐棗汁濃度增加，雌雄果蠅在第20天及40天的體內(nèi)T-SOD活性均不斷增強(qiáng)，且與CK組存在極顯著差異(P<0.01)。其中，活菌型發(fā)酵拐棗汁對(duì)雌雄果蠅體內(nèi)T-SOD酶活力提升又強(qiáng)于滅菌型。以活菌型為例，在飼喂第20天時(shí)，當(dāng)劑量為15 g/L時(shí)，雌雄果蠅體內(nèi)T-SOD活力最大，分別為429.85、431.53 U/mg蛋白；在飼喂第40天時(shí)，同樣當(dāng)劑量為15 g/L時(shí)，雌雄果蠅體內(nèi)T-SOD活力最大，分別為248.06、255.60 U/mg蛋白。其中，飼喂40日齡較20日齡果蠅體內(nèi)T-SOD活力顯著降低(P<0.05)，這是因?yàn)?0日齡果蠅開(kāi)始進(jìn)入衰老期，而20日齡果蠅正處于青年生長(zhǎng)期，因此20 d齡果蠅體內(nèi)T-SOD酶活力更強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張欣文等的研究結(jié)果基本一致[21]。

2.4 發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅體內(nèi)T-AOC活性的影響

由表3可知，隨著發(fā)酵拐棗汁濃度增加，雌雄果蠅在第20天及40天的體內(nèi)T-AOC活性不斷增強(qiáng)。除滅菌型5 g/L飼喂40 d的雌果蠅體內(nèi)T-AOC活性與CK組相比未顯著提高外(P>0.05)，其余劑量組基本極顯著高于CK組(P<0.01)。其中，活菌型發(fā)酵拐棗汁對(duì)雌雄果蠅體內(nèi)T-AOC活性提升又強(qiáng)于滅菌型。以活菌型為例，在飼喂第20天時(shí)，當(dāng)劑量為15 g/L時(shí)，雌雄果蠅體內(nèi)T-AOC活性最大，分別為4.92、5.06 L/g蛋白；在飼喂第40天時(shí)，同樣當(dāng)劑量為15 g/L時(shí)，雌雄果蠅體內(nèi)T-AOC活性最大，分別為3.75、3.83 L/g蛋白。表明活菌型及滅菌型均能顯著增強(qiáng)雌雄果蠅體內(nèi)T-AOC活性。

表2 不同劑量發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅T-SOD酶活力的影響Table 2 Effects of different doses of fermented Hoveniadulcis fruit pedicel juice on T-SOD activity in D. melanogaster

表3 不同劑量發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅T-AOC活性的影響Table 3 Effects of different doses of fermented Hoveniadulcis fruit pedicel juice on T-AOC activity in D. melanogaster

2.5 發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅體內(nèi)MDA含量的影響

由表4可知，隨著發(fā)酵拐棗汁濃度增加，雌、雄果蠅在第20天及40天的體內(nèi)MDA含量呈降低趨勢(shì)。當(dāng)飼喂?jié)舛葹?5 g/L時(shí)，用活菌型飼喂20 d的雌雄果蠅體內(nèi)MDA含量分別為1.07、0.58 mmol/mg蛋白，飼喂40 d的雌雄果蠅體內(nèi)MDA含量分別為4.57、2.59 mmol/mg蛋白；用滅菌型飼喂20 d的雌雄果蠅體內(nèi)MDA含量分別為1.40、0.75 mmol/mg蛋白，飼喂40 d的雌雄果蠅體內(nèi)MDA含量分別為4.87、3.46，均顯著低于對(duì)應(yīng)CK組MDA含量(P<0.05)，表明活菌型及滅菌型均能顯著降低雌雄果蠅體內(nèi)MDA含量。

表4 不同劑量發(fā)酵拐棗汁對(duì)果蠅MDA含量的影響Table 4 Effects of different doses of fermented Hoveniadulcis fruit pedicel juice on MDA content in D. melanogaster

3 結(jié)論

本文利用DPPH·、·OH、ABTS+·清除率等指標(biāo)評(píng)價(jià)乳酸發(fā)酵拐棗汁的體外抗氧化活性，同時(shí)檢測(cè)了其對(duì)果蠅壽命和體內(nèi)抗氧化的影響。研究發(fā)現(xiàn)隨著活菌型及滅菌型拐棗汁飼喂劑量的增大，雌雄果蠅體內(nèi)T-SOD、T-AOC活性均不斷增強(qiáng)，MDA含量不斷降低，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。綜上活菌型和滅菌型發(fā)酵拐棗汁具有較強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)還具有明顯延長(zhǎng)果蠅壽命、延緩果蠅衰老、提高果蠅體內(nèi)抗氧化活性的作用，為以后發(fā)酵拐棗汁的實(shí)際開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。