喻理，馬飛，趙安順，白藝珍，李董，李培武

1(農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測重點實驗室，國家農(nóng)業(yè)檢測基準(zhǔn)實驗室(生物毒素)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢，430062)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京，100122)

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌侵染食品產(chǎn)生的一類香豆素衍生物，目前已知的黃曲霉毒素有十幾種，最常見的有黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、B2(aflatoxin B2, AFB2)、G1(aflatoxin G1, AFG1)、G2(aflatoxin G2, AFG2)、M1(aflatoxin M1, AFM1)、M2(aflatoxin M2, AFM2)六種，其中AFB1早在1993年就被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為I類致癌物質(zhì)。黃曲霉毒素極易污染谷物、花生、玉米、糧油、飼料等食品和農(nóng)產(chǎn)品，嚴(yán)重危害人畜安全。

食品污染物檢測與分析是控制食品安全的重要方式，對保障食品安全發(fā)揮著重要作用。由于黃曲霉毒素具有穩(wěn)定性強(qiáng)、不易清除、前端管控難等特點，因此，對食品和農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素進(jìn)行檢測與分析成為了控制毒素危害的主要措施之一，也一直是科學(xué)界研究的熱點。目前，出版的黃曲霉毒素檢測分析研究文獻(xiàn)已經(jīng)超過了2 000篇。常見的黃曲霉毒素檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附法等，這些方法各有利弊，如所需儀器昂貴、操作要求高、前處理復(fù)雜耗時等。電化學(xué)分析方法是繼上述方法之后發(fā)展的一種分析方法，因操作簡單、價格低廉、靈敏度高、響應(yīng)快等優(yōu)點，在食品檢測分析領(lǐng)域特別是黃曲霉毒素檢測分析中應(yīng)用廣泛[1-4]。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，利用納米材料的優(yōu)良物理化學(xué)性能，將其整合進(jìn)電化學(xué)分析中以提升檢測靈敏度和穩(wěn)定性，減少基質(zhì)效應(yīng)，成為近年來電化學(xué)分析研究的新趨勢。碳納米材料具有高比表面積，優(yōu)異的電傳輸能力，良好的生物兼容性和易于官能化等優(yōu)點，尤其受到分析研究領(lǐng)域科研工作者的青睞，在真菌毒素的電化學(xué)分析檢測中發(fā)揮著越來越大的作用[5-6]。本文在簡單概述了黃曲霉毒素檢測方法和碳納米材料在電化學(xué)分析應(yīng)用中的主要功能作用的基礎(chǔ)上，對基于碳納米材料的黃曲霉毒素電化學(xué)檢測方法做了詳細(xì)介紹，并對其發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 黃曲霉毒素檢測方法

1.1 黃曲霉毒素傳統(tǒng)檢測方法

黃曲霉毒素是一類強(qiáng)致癌的生物毒素，由于其污染多種糧油作物和食品，且不易管控，世界各國均制定了嚴(yán)格的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，以保障人民的身體健康。我國國標(biāo)(GB 2761—2017)規(guī)定谷物及其制品中AFB1限量在5.0～20 μg/kg，歐盟(EU)No165/2010規(guī)定堅果中AFB1的限量為2 μg/kg，黃曲霉毒素總量的限量值為4 μg/kg。日益嚴(yán)格的黃曲霉毒素限量規(guī)定，對其檢測方法提出了更高的要求和更大的挑戰(zhàn)。

薄層色譜法(thin-layer chromatography, TLC)是最早的黃曲霉毒素檢測方法[7]，其原理是：將黃曲霉毒素經(jīng)過提取、濃縮、薄層分離后，在紫外光照射下觀察其熒光特性，以產(chǎn)生的熒光信號強(qiáng)弱來對毒素的含量進(jìn)行定性分析，方法的缺點是操作過程繁瑣復(fù)雜、溶劑消耗大、對實驗人員危害大、重現(xiàn)性差、靈敏度低。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[8]和液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometer, LC-MS)[9]是基于色譜原理的儀器分析方法，其優(yōu)點是檢出限低，一般檢出限可達(dá)μg/kg，缺點是依賴大型儀器，成本高，前處理復(fù)雜。免疫層析法(immunochromatographic assay, ICA)[10]和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[11]是基于抗體與檢測物發(fā)生免疫反應(yīng)而建立起來的免疫分析方法，優(yōu)點是操作簡單，缺點是受基質(zhì)影響大，檢測靈敏度和準(zhǔn)確性不及儀器分析方法。

由于傳統(tǒng)檢測方法均有局限，因此探索環(huán)境友好、方便快捷、靈敏準(zhǔn)確的黃曲霉毒素分析方法成為眾多研究人員近年來努力的方向。

1.2 黃曲霉毒素電化學(xué)分析方法

電化學(xué)分析法是一種依據(jù)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)來測定物質(zhì)組成及含量的分析方法。主要檢測原理是將被測物與檢測物發(fā)生的生物或化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的信號經(jīng)過換能器轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的電信號，必要時經(jīng)放大器將電信號再次放大并輸出，以電信號的變化來間接分析待測物的濃度，常見檢測物質(zhì)有活性氧、酶、脫氧核糖核酸、葡萄糖等[12]。電化學(xué)分析方法自上世紀(jì)五六十年代起得到了較大的發(fā)展，作為生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等多學(xué)科互相滲透成長起來的交叉學(xué)科研究領(lǐng)域，因儀器簡單、價格低廉、易于操作(通常不需要特殊的技術(shù)以及對前處理沒有特別的要求)、靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性高、響應(yīng)快等優(yōu)點在生命、環(huán)境、食品安全等多個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[13-16]。1997年ANDREOU等首次將電化學(xué)分析方法用于脫脂牛奶中AFM1的檢測[17]，隨后黃曲霉毒素的電化學(xué)分析方法研究逐漸發(fā)展成為當(dāng)前黃曲霉毒素檢測分析研究中最活躍的領(lǐng)域之一[1,4,13,18]。

根據(jù)檢測的電信號的不同，黃曲霉毒素電化學(xué)分析法可以分為電流型、電導(dǎo)型、電位型和阻抗型等。電流型(又稱安培型)的工作原理是在電壓一定的情況下，通過檢測待測物引發(fā)的響應(yīng)電流，對待測物進(jìn)行定量分析。譚蕓[19]就構(gòu)建了一種電流型的檢測黃曲霉毒素的電化學(xué)分析方法：首先利用抗原抗體反應(yīng)，將標(biāo)記了辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)的抗體固定在電極表面，在HRP催化下，H2O2將對苯二酚氧化成對苯醌，對苯醌在電極上被還原，產(chǎn)生還原電流，以此來檢測黃曲霉毒素。這類檢測方法簡單，成本低，但在固定材料、標(biāo)記系統(tǒng)和電活性物質(zhì)等方面還需改進(jìn)。電導(dǎo)型的工作原理是基于待測物與檢測物反應(yīng)所引起的平行電極間電導(dǎo)變化來對待測物濃度進(jìn)行測定的分析方法。LIU等[20]基于一種金微叉指電極和HRP建立了一種AFB1電化學(xué)免疫檢測方法，該方法通過觀察電解質(zhì)電導(dǎo)的變化來測定AFB1的濃度。電導(dǎo)型分析方法易受待測物樣品中的離子強(qiáng)度與緩沖液電容的變化影響，導(dǎo)致非特異性問題。電位型(又稱電勢型)的工作原理是基于測量電位變化來對待測物進(jìn)行定量分析。LAROU等[21]基于生物電識別檢測AFM1，該方法通過測量細(xì)胞膜上的電位變化來計算出待測樣品中AFM1的含量。電位型檢測方法成本低、反應(yīng)快，但易受基質(zhì)影響，在實際樣品的檢測中應(yīng)用比電流型少。阻抗型的工作原理是以電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化值來反映被測物的量。OWINO等[22]在一種電合成聚苯胺的平臺上構(gòu)建了一種免疫阻抗響應(yīng)的AFB1檢測方法，將AFB1抗體固定在由聚苯胺和聚(苯乙烯磺酸)修飾的鉑電極上，通過檢測電子轉(zhuǎn)移的情況來推導(dǎo)出AFB1的濃度。阻抗型檢測方法的靈敏度較高、反應(yīng)快，但體系成熟度不高，是當(dāng)前主流類型中研究的熱點。

雖然目前的電化學(xué)分析方法已經(jīng)能夠?qū)S曲霉毒素進(jìn)行簡便、快速、特異和靈敏的檢測與分析，但在實際應(yīng)用中仍會受到如基質(zhì)效應(yīng)、抗體固定、信號傳輸?shù)炔怀墒斓囊蛩氐挠绊?。為了能?gòu)建更靈敏、更準(zhǔn)確、更實用的新型電化學(xué)檢測模式與方法，具有多種優(yōu)良性能的納米材料特別是碳納米材料被引入到電化學(xué)分析中，并已展現(xiàn)出了巨大的潛在應(yīng)用價值[23]。

2 碳納米材料在電化學(xué)分析中的應(yīng)用

碳納米材料是指材料的三維尺度中至少有一維小于100 nm的碳材料。主要包括零維的碳量子點、富勒烯，一維的碳納米管、碳納米纖維，二維的石墨烯等及它們的衍生物。碳納米材料不僅具有納米效應(yīng)，還有優(yōu)異的電學(xué)性能(如較寬的電位窗口、快速的電子傳輸速度等)、強(qiáng)大的吸附性能、良好的化學(xué)穩(wěn)定性和易于官能化的特性、良好的形狀可控性和生物相容性等，為其在電化學(xué)分析中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[24]。

目前，碳納米材料在黃曲霉毒素電化學(xué)分析應(yīng)用中的主要作用有：充當(dāng)生物分子的固載基體，提高電子傳輸速度，提升界面的電催化性能，吸附目標(biāo)物和穩(wěn)定體系等[25]。通常，碳納米材料在電化學(xué)分析中的應(yīng)用往往不僅僅局限于單一的作用與功能，大多時候是多功能的有效疊加來協(xié)同完成其對黃曲霉毒素分析性能的提升。如ARATI等[26]用納米金(gold nanoparticles, AuNPs)修飾聚(3，4-乙烯二氧噻吩)(poly(2,3-dihydrothieno-1,4-dioxin), PEDOT)-氧化石墨烯(graphene oxide, GO)的納米復(fù)合材料，構(gòu)建了一種AFB1的電化學(xué)免疫分析方法。研究人員首先采用循環(huán)伏安法(cycle voltammetry, CV)和電化學(xué)阻抗譜法(electrochemical impedance spectroscopy, EIS)系統(tǒng)研究了被修飾的玻碳電極(glassy carbon electrode, GCE)的電催化行為，然后發(fā)現(xiàn)電流信號與磷酸緩沖液中的AFB1濃度在0.5～20 ng/mL和20～60 ng/mL兩個區(qū)間內(nèi)呈線性關(guān)系，由此構(gòu)建的檢測方法的靈敏度分別為0.989和0.397 μA/(ng/mL)，檢出限為0.109 ng/mL。該方法也被證實可以用于實際樣品檢測，在玉米的AFB1檢測分析中的檢出限為0.09 ng/mL。在這個方法的構(gòu)建中GO不僅充當(dāng)了抗體和納米金顆粒的固載平臺，同時為電子的快速傳輸提供了便利。GAN等[27]基于磁性氧化石墨烯萃取AFM1和抗體標(biāo)記的碲化鎘(CdTe)量子點(quantum dots，QDs)-碳納米管納米(carbon nanotubes, CNTs)復(fù)合材料構(gòu)建了一種超靈敏的電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescent, ECL)免疫分析方法檢測牛奶中AFM1。該方法不僅利用了碳納米材料的良好吸附特性，還證明了CNTs對ECL信號的放大作用。方法原理是將GO-Fe3O4磁性復(fù)合材料作為吸附劑提取牛奶中的AFM1，再將黃曲霉毒素M1抗體(AFM1-Ab1)與CdTe QDs-CNTs復(fù)合物結(jié)合形成信號標(biāo)記物，并固定在絲網(wǎng)印刷碳電極(screen printed carbon electrode, SPCE)上，利用抗原抗體特異性識別反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光信號的強(qiáng)度來判定AFM1的含量。經(jīng)過一系列的條件優(yōu)化，AFM1在1.0～1.0×105pg/mL對數(shù)與電化學(xué)發(fā)光信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，由此構(gòu)建的分析方法檢出限為0.3 pg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA方法。由此可見，碳納米材料的多種優(yōu)良特性已經(jīng)被有效整合用于黃曲霉毒素的電化學(xué)分析中。

3 基于碳納米材料的黃曲霉毒素電化學(xué)檢測方法

3.1 石墨烯類納米材料在黃曲霉毒素電化學(xué)檢測分析中的應(yīng)用

石墨烯(graphene, G)是由sp2雜化的碳原子組成的具有六角形蜂窩狀結(jié)構(gòu)的原子級厚度的二維納米材料，是所有碳材料的基本組成單元。G具有快速的電子傳遞速率(200 000 cm2/(V·s))、優(yōu)良的機(jī)械性能、高的熱導(dǎo)率、大的比表面積(單層石墨烯的理論比表面積達(dá)2 630 m2/g)和良好的生物相容性[28]，在電化學(xué)分析方法研究中應(yīng)用廣泛。GO是石墨烯片層被不同程度氧化后產(chǎn)生的一類石墨烯的衍生物，其制備通常由石墨氧化而成，比G獲得更方便。GO因氧化程度不同，含氧官能團(tuán)數(shù)量略有不同[29]，由氧化而引起的豐富電化學(xué)缺陷與功能基團(tuán)(羥基、羧基、羰基等)使其具有很強(qiáng)的耦合性，很容易與電化學(xué)活性物質(zhì)、生物分子等物質(zhì)偶聯(lián)。含氧官能團(tuán)的存在還使其具有良好的生物兼容性與親水性，保證了偶聯(lián)后的多種生物分子結(jié)構(gòu)與活性不被破壞，為構(gòu)建不同檢測模式的黃曲霉毒素分析方法提供了便利。SRIVASTAVA等[30]將氧化石墨烯溶液均勻分散在金(Au)電極表面構(gòu)建了GO/Au電極，通過偶聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與活化劑N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)成功地將黃曲霉毒素抗體(anti-AFB1)固定在電極表面，并用牛血清蛋白(bull serum albumin, BSA)封閉電極表面非特異性位點構(gòu)建了BSA/anti-AFB1/GO/Au免疫復(fù)合電極。采用EIS研究了該電極在含鐵氰化鉀的磷酸緩沖溶液中的電荷轉(zhuǎn)移電阻(charge transfer resistance, Rct)與AFB1濃度的函數(shù)關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)AFB1在0.5～5 ng/mL，Rct與AFB1濃度呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.23 ng/mL。

雖然GO易于偶聯(lián)修飾，但是含氧官能團(tuán)的存在也在一定程度上導(dǎo)致其導(dǎo)電性下降，限制了電信號傳輸速度。還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)是對GO片層的含氧官能團(tuán)進(jìn)行部分還原的石墨烯類納米材料，結(jié)構(gòu)與GO和G類似，但與GO相比，具有更快的電子傳輸速度，因此，在黃曲霉毒素的電化學(xué)分析中應(yīng)用更為廣泛。

SRIVASTAVA等[31]采用電泳沉積技術(shù)將rGO沉積在氧化銦錫(indium tin oxide, ITO)導(dǎo)電玻璃上，通過EDC/NHS法將黃曲霉毒素抗體(anti-AFB1)共價交聯(lián)到rGO/ITO上，并運用CV和EIS研究了其電化學(xué)行為。當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度在0.125～1.5 ng/mL時，陽極峰值電流與AFB1質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99，檢出限為0.15 ng/mL，靈敏度為68 μA/[(ng·mL-1)·cm2]。

近年來，科研人員又利用貴金屬良好的電催化能力，將貴金屬與石墨烯材料復(fù)合，建立了多種黃曲霉毒素電化學(xué)分析方法。SRIVASTAVA等[32]用金納米粒子修飾的rGO沉積在ITO玻璃上構(gòu)建了Au@rGO/ITO免疫電極，通過電流響應(yīng)信號來檢測AFB1，檢測范圍在0.1～12 ng/mL，檢出限達(dá)0.1 ng/mL，比僅用rGO的檢出限低。最近他們又利用水合肼將鎳納米粒子(Ni nanoparticles, Ni NPs)修飾在rGO上，再將復(fù)合材料沉積在ITO玻璃上構(gòu)建了rGO-Ni NPs/ITO復(fù)合電極，用差分脈沖法(differential pulse voltammetry, DPV)檢測AFB1毒素，構(gòu)建的方法在1～8 ng/mL靈敏度達(dá)129.6 μA/[(ng·mL-1)·cm2]，高靈敏度主要歸功于rGO和Ni NPs間的協(xié)同效應(yīng)[33]。ALTHAGAFI等[34]將金納米點修飾的rGO納米材料沉積到ITO導(dǎo)電玻璃上，再將抗體固定到復(fù)合電極上，利用抗原抗體反應(yīng)后導(dǎo)致的電流值的變化，采用CV的電化學(xué)檢測技術(shù)構(gòu)建了一種超靈敏的AFB1檢測方法，檢出限可達(dá)到6.9 pg/mL，并在檢測低濃度AFB1的加標(biāo)花生樣品中取得了良好效果。最近，石墨烯量子點(graphene quantum dots，GQDs)也基于上述檢測模式被用于黃曲霉毒素電化學(xué)檢測分析中。SHADJOU等[35]發(fā)明了一種AFM1電化學(xué)分析方法，該方法將石墨烯量子點、α-環(huán)糊精(α-cyclodextrin, α-CD)和銀納米粒子(silver nanoparticles, AgNPs)依次沉積到GCE上，制備了一種三元復(fù)合薄膜，通過線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry，LSV)建立了AFM1檢測方法。在此方法中α-環(huán)糊精作為傳導(dǎo)介質(zhì)，GQDs作為穩(wěn)定劑，AgNPs作為電催化劑，共同促成了檢測信號放大的目標(biāo)。在最優(yōu)條件下，方法的檢測范圍為0.015～25 mmol/L，定量限為2 μmol/L，該方法可用于未經(jīng)任何處理的牛奶中AFM1的檢測。SHU等[36]將四苯基卟啉鈷(cobalt tetraphenyl porphyrin, CoTPP)和鉑納米粒子(platinum nanoparticles, PtNPs)功能化的rGO與AFB1抗體復(fù)合，形成anti-AFB1/PtNPs/CoTPP/rGO復(fù)合物。利用復(fù)合物與偶聯(lián)了AFB1-BSA的納米金修飾的GCE發(fā)生免疫反應(yīng)，以PtNPs/CoTPP/rGO納米復(fù)合物催化H2O2的還原產(chǎn)生的還原電流為電化學(xué)信號，采用差分脈沖伏安法建立了一種基于競爭型免疫分析模式的AFB1電化學(xué)分析方法，檢出限達(dá)1.5 pg/mL。

導(dǎo)電聚合物是近年來電化學(xué)研究的熱點之一。離子液體具有較高的電導(dǎo)率，常作為電解液應(yīng)用于電化學(xué)分析中。除了貴金屬，導(dǎo)電聚合物和離子液體也常和石墨烯類納米材料一起被用于黃曲霉毒素的檢測分析中。王瑞鑫等[37]將殼聚糖(chitosan, CS)、石墨烯和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸鹽離子液體(1-butyl-3-methyl imidazolium tetrafluoroborate ionic liquid, IL)混合溶液通過縮合反應(yīng)固定在GCE上，再將AFB1抗體包埋固定，構(gòu)建一種可用于快速測定食品中的AFB1的電化學(xué)免疫分析方法。運用CV和DPV法研究免疫反應(yīng)對電極響應(yīng)電流的影響，優(yōu)化條件后，通過峰電流的降低值和AFB1濃度對數(shù)的線性關(guān)系，建立了檢測范圍在0.1～8.1 ng/mL的檢測方法，檢出限為0.04 ng/mL。并將該方法成功用于花生和玉米油樣品中AFB1的檢測中，回收率在94.73%～104.41%。WANG等[38]將還原氧化石墨烯、聚吡咯(polypyrrole, PPy)和吡咯丙酸(pyrrole propanoic acid, PPa)的復(fù)合溶液采用恒電流聚合法一步制成PPy/PPa/rGO納米復(fù)合物薄膜在GCE電極上，并通過共價偶聯(lián)將抗體固定在PPy/PPa/rGO/GCE電極表面，用于AFB1的超靈敏檢測。通過探究抗體修飾后的電極在測試待測物前后的Rct變化與待測物中AFB1濃度之間的對應(yīng)關(guān)系，建立了一個靈敏的AFB1檢測方法，該方法在10 fg/mL～10 pg/mL的檢測范圍對AFB1有很好的響應(yīng)。該方法不僅靈敏度低(檢出限10 fg/mL)，還具有很好的特異性，在相同濃度水平下，對AFB2、AFG1和AFG2的交叉反應(yīng)率分別為5.0%，30.6%和20.1%，對嘔吐毒素和赭曲霉毒素的交叉反應(yīng)率均低于1.0%。

隨著石墨烯類納米材料在黃曲霉毒素電化學(xué)分析中應(yīng)用研究的不斷深入，科研人員也嘗試將貴金屬、離子液體或?qū)щ娋酆衔锱c石墨烯類納米材料三者有機(jī)結(jié)合來協(xié)同提升黃曲霉毒素電化學(xué)分析的性能。SHI等[39]用納米金修飾聚苯胺(polyaniline, PANI)/石墨烯納米復(fù)合材料，并將其固定在金電極上形成Au/PANI/G/Au電極的檢測傳感器，利用免疫反應(yīng)和方波伏安法(square wave cyclic voltammetry, SWV)建立AFB1的電化學(xué)分析方法，檢測范圍在0.05～25 ng/mL，檢出限為0.034 ng/mL。ZHOU等[40]將GO、導(dǎo)電聚合物(2,5-di-(2-thienyl)-1-pyrrole-1-(pbenzoic acid), DPB)和金納米粒子依次電沉積到金電極表面，緊接著通過EDC/NHS將黃曲霉毒素的抗體共價偶聯(lián)在導(dǎo)電聚合物膜上，最后又將含殼聚糖的離子液體修飾在電極表面制備了用于食品樣品中AFB1的電化學(xué)阻抗免疫分析方法。其中，石墨烯和金納米顆粒保證了電子的快速傳輸，離子液體為抗體提供了一個溫和的微環(huán)境，電化學(xué)阻抗測試保障了檢測的高靈敏度。建立的AFB1的檢測方法在3.2×10-15～0.32×10-12mol/L具有良好線性關(guān)系，檢出限低至1.0×10-15mol/L，且對花生、大米、牛奶、面粉、大豆等食品樣品的加標(biāo)回收率在96.3%～101.2%，具有良好的精密度和準(zhǔn)確性。

石墨烯納米材料除了可以用于基于抗原抗體免疫反應(yīng)的電化學(xué)檢測模式，也同樣適用于適配體(aptamer, Apt)識別黃曲霉毒素的電化學(xué)檢測模式。GOUD等[41]就基于功能化氧化石墨烯(functional graphene oxide, FGO)和適配體技術(shù)構(gòu)建了一種可用于酒精飲料中AFB1的檢測方法，F(xiàn)GO被沉積在了絲網(wǎng)印刷碳電極上(screen-printed carbon electrode, SPCE)，己二胺(hexamethylenediamine, HMDA)通過EDC/NHS共價偶聯(lián)在FGO上，形成了一個空間結(jié)構(gòu)，再將可識別AFB1的標(biāo)記有亞甲基藍(lán)(methylene blue, MB)的適配體共價偶聯(lián)到HMDA上，通過適配體識別AFB1產(chǎn)生的空間結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的亞甲基藍(lán)電信號的變化來進(jìn)行定量檢測。FGO在其中不僅作為固定適配體的平臺，同時能輔助電催化放大亞甲基藍(lán)電化學(xué)信號。構(gòu)建的方法在0.05～6 ng/mL具有很好的線性關(guān)系，檢出限為0.05 ng/mL。

GELETA等[42]構(gòu)建了一種基于還原氧化石墨烯/二硫化鉬/聚苯胺納米復(fù)合材料的黃曲霉毒素電化學(xué)分析方法，他們將合成的納米復(fù)合材料與殼聚糖混合后包覆在玻碳電極表面，然后將納米金和AFB1適配體依次修飾到電極上，利用毒素與適配體發(fā)生的空間結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的電子交換的阻滯引起的電流響應(yīng)變化，通過DPV法建立了AFB1的檢測方法，檢測范圍在1.0×10-17～1.0×10-15g/mL，檢出限為2×10-18g/mL。該方法的選擇性強(qiáng)，并已經(jīng)成功用于酒中AFB1的檢測。

KHOSHFETRAT等[43]開發(fā)了一種基于適配體技術(shù)和GO的用于牛奶中AFM1檢測的電化學(xué)發(fā)光方法。首先，硫醇化的AFM1適配體固定在金納米粒子覆蓋的磁性納米顆粒(gold-coated magnetic nanoparticles，GMNPs)上，形成Apt-GMNPs復(fù)合物。魯米諾官能化的銀納米粒子修飾的氧化石墨烯(luminol-functionalized, silver nanoparticle-decorated, graphene oxide, GO-L-AgNPs)通過GO與適配體上未配對的堿基產(chǎn)生的π-π作用，成功與Apt-GMNPs結(jié)合，形成Apt-GMNPs-GO-L-AgNPs復(fù)合物。當(dāng)AFM1存在時，適配體與毒素反應(yīng)導(dǎo)致GO-L-AgNPs脫離，由此導(dǎo)致了電化學(xué)發(fā)光信號的變化。基于上述原理作者建立了一種AFM1的分析范圍在5～150 ng/mL、檢出限為0.01 ng/mL的分析方法，該方法已經(jīng)成功地用于牛奶中AFM1的檢測，且重現(xiàn)性可靠。

3.2 碳納米管在黃曲霉毒素電化學(xué)檢測分析中的應(yīng)用

碳納米管是由層狀結(jié)構(gòu)的石墨片層卷曲而成的一類碳納米材料。按照管壁片層數(shù)分類，碳納米管主要分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes, SWCNTs)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs)。碳納米管中碳原子以sp2雜化為主，同時六角型網(wǎng)格結(jié)構(gòu)存在一定程度的彎曲，形成空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中可形成一定的sp3雜化鍵，即形成的化學(xué)鍵同時具有sp2和sp3混合雜化狀態(tài)，而這些p軌道彼此交疊在碳納米管的片層外，形成高度離域化的大π鍵，碳納米管外表面的大π鍵是碳納米管與一些具有共軛性能的大分子以非共價鍵復(fù)合的化學(xué)基礎(chǔ)。由于共軛效應(yīng)顯著，碳納米管具有一些特殊的電學(xué)性能，它既具有金屬性和半導(dǎo)體性，又具有較高的導(dǎo)電性和良好的電催化活性，因而成為一種優(yōu)良的電子傳輸體，在電化學(xué)檢測分析中能大大加快電子在電活性物質(zhì)之間的傳遞[44]。

利用免疫反應(yīng)建立檢測模式，再利用碳納米管的優(yōu)異電化學(xué)特性，科研人員開發(fā)了不少黃曲霉毒素電化學(xué)免疫分析方法。SINGH等[45]將羧基化多壁碳納米管(carboxylated multiwalled carbon nanotubes，c-MWCNTs)通過電泳技術(shù)一步沉積在ITO玻璃上制得c-MWCNTs/ITO復(fù)合電極。通過EDC和NHS將黃曲霉單克隆抗體(anti-AFB1)共價偶聯(lián)在復(fù)合電極上，并用BSA封閉其非特異性活性位點，制備了BSA/anti-AFB1/MWCNTs/ITO免疫電極。此電極的締合常數(shù)低至0.091 5 ng/mL，表明此電極對AFB1有很強(qiáng)的親和力。利用循環(huán)伏安技術(shù)建立分析方法，結(jié)果表明，AFB1檢測的線性范圍在0.25～1.375 ng/mL，檢出限為0.08 ng/mL，靈敏度高達(dá)95.2 μA/[(ng·mL-1)·cm2]。ZHANG等[46]設(shè)計了一種基于單壁碳納米管/殼聚糖(SWCNTs/CS)的間接競爭型AFB1電化學(xué)免疫分析方法。首先，將SWCNTs/CS納米復(fù)合物滴涂在玻碳電極表面，制得SWCNTs/CS/GCE電極；經(jīng)EDC/NHS反應(yīng)將AFB1-BSA固定在電極表面，用BSA封閉多余的位點。然后，利用AFB1抗體與固定在電極表面的AFB1-BSA和待測液中游離的AFB1競爭，將AFB1抗體固定在電極上之后，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)標(biāo)記的二抗(AP-anti-antibody)通過與一抗反應(yīng)被選擇性固定到電極表面。最后，復(fù)合電極被沉浸在含α-萘基磷酸(α-naphthyl Phosphate，α-NP)的二乙醇胺溶液中，通過堿性磷酸酶催化水解α-NP產(chǎn)生的電化學(xué)信號來達(dá)到間接檢測AFB1濃度的目的。差分脈沖伏安測試結(jié)果表明，在0.01～100 ng/mL，電流密度隨AFB1濃度的對數(shù)呈線性降低，檢出限低至3.5 pg/mL。在實際玉米粉樣品中對AFB1的檢出限低至13.5 pg/mL，大大低于大多數(shù)國家設(shè)置的限量標(biāo)準(zhǔn)。

碳納米管也常與具有電活性的物質(zhì)(如離子液體)一起用于黃曲霉毒素的電化學(xué)檢測分析中。YU等[47]將多壁碳納米管、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，[BMIM]PF6)離子液體和黃曲霉毒素抗體組成的復(fù)合物修飾在GCE電極表面，通過與黃曲霉毒素發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，用免疫反應(yīng)前后其電子傳輸電阻與AFB1濃度的線性關(guān)系來檢測黃曲霉毒素，檢測范圍在0.1～10 ng/mL，檢出限低至0.03 ng/mL，并成功用于橄欖油中黃曲霉毒素的檢測。ZHANG等[48]將電活性物質(zhì)聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly(diallyl dimethyl ammonium chloride), PDDA)作為碳納米管的分散劑和電荷調(diào)節(jié)劑，制備出碳納米管/聚二烯丙基二甲基氯化銨/鈀金納米粒子(CNTs/PDDA/Pd-Au)復(fù)合物，將其修飾在金電極上，再將黃曲霉毒素抗體(anti-AFB1)和BSA依次固定在電極上，利用免疫反應(yīng)和差分脈沖伏安法來對AFB1進(jìn)行定量分析，構(gòu)建的方法的檢測范圍在0.05～25 ng/mL，檢出限達(dá)0.03 ng/mL，并成功用于污染大米的檢測中。

貴金屬能與多種生物分子兼容，且有良好的電催化活性，因此，與碳納米管共同構(gòu)建的黃曲霉毒素電化學(xué)分析方法也屢有報道。LI等[49]將黃曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase, AFO)嵌入硅的溶膠-凝膠溶液中與多壁碳納米管修飾的鉑電極偶聯(lián)，形成AFO sol-gel/MWCNT/Pt電極，用于催化氧化AFB1，通過計時電流法(chronoamperometry, I-t)建立了黃曲霉毒素電化學(xué)分析方法，該方法在AFB1濃度為3.2×10-9～721×10-9mol/L呈良好線性，靈敏度為0.33×102A/[(mol·L-1)·cm2]，檢出限為1.6×10-9mol/L。WANG等[50]采用分步法構(gòu)建了一種分子印跡的AFB1電化學(xué)檢測方法。首先將Au/Pt雙金屬納米粒子(Au/Pt bimetallic Nanoparticles, Au/PtNPs)電沉積在多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，然后將鄰苯二胺(OPD)和AFB1電聚合在Au/PtNPs-MCNTs-GCE電極表面，最后用鹽酸將印跡分子AFB1去除得到MIPOPD-Au/PtNPs-MCNTs-GCE電極。通過循環(huán)伏安技術(shù)、差分脈沖伏安技術(shù)和電化學(xué)阻抗譜考察了其電化學(xué)分析的性能。由差分脈沖伏安技術(shù)建立了AFB1電化學(xué)分析方法，檢測范圍在1×10-10～1×10-5mol/L，檢出限為0.03 nmol/L，并證實該方法可應(yīng)用于地溝油中AFB1的檢測。

3.3 其他碳納米材料在黃曲霉毒素電化學(xué)檢測分析中的應(yīng)用

其他碳納米材料如碳納米角、介孔碳、碳量子點、碳納米球等也因為其不同的微觀結(jié)構(gòu)和獨特的物理化學(xué)特性，被用于電化學(xué)分析中。如介孔碳材料具有高電導(dǎo)率、物理化學(xué)穩(wěn)定性和高比表面積等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于催化領(lǐng)域中，特別是用于電極材料和電催化劑等[51]。碳納米球具有規(guī)則的幾何外形、較高的比表面和良好的生物相容性，常被用于制備新型多酶標(biāo)記物[52]，用于放大信號提升分析的靈敏度。

近年來，也有其他的碳納米材料被用于黃曲霉毒素的電化學(xué)分析檢測。MONDAL等[53]采用靜電紡絲技術(shù)和旋轉(zhuǎn)涂布技術(shù)在硅晶片表面合成了聚甲基丙烯酸甲酯(poly(methyl methacrylate), PMMA)和聚丙烯腈(polyacrylonitrile, PAN)的兩層復(fù)合膜，再經(jīng)高溫炭化分解去除聚PMMA纖維，制備出內(nèi)嵌在PAN無定型碳電極上的微孔孔道，然后再采用熱分解法將鉑納米粒子修飾在微孔孔道上，通過EDC/NHS將黃曲霉毒素單克隆抗體共價交聯(lián)到PtNPs/微孔碳電極表面，通過免疫反應(yīng)引起的阻抗變化建立了黃曲霉毒素分析方法，檢測范圍在1.0×10-12～0.1×10-6g/mL，檢出限為1.0×10-12g/mL。微孔碳電極不僅為PtNPs的沉積和抗原抗體反應(yīng)提供了一個微環(huán)境，而且使得電子傳輸速度提升，從而促進(jìn)了電化學(xué)性能的提升。

XU等[54]構(gòu)建了一種基于碳納米角(carbon nanohorns, CNHs)和磁性納米材料的AFB1電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。在磁性玻碳電極(magnetic glassy carbon electrode, MGCE)上依次修飾上CNHs和吸附了魯米諾的Fe3O4磁性纖維(luminol-functionalized Fe3O4nanofibers, L-Fe3O4-NFs)，通過共價反應(yīng)將黃曲霉毒素抗體偶聯(lián)在L-Fe3O4-NFs/CNHs/MGCE復(fù)合電極，用BSA封閉非特異性位點，利用免疫反應(yīng)和魯米諾產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號來建立AFB1檢測方法。具有優(yōu)良導(dǎo)電性、生物相容性、大比表面積和可變孔隙度的CNHs可以大大提升魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號，F(xiàn)e3O4納米材料可以大量吸附信號材料魯米諾，也是固定抗體的基底，并使得抗體能大量富集到MGCE表面。建立的AFB1的分析方法檢出限可達(dá)0.02 ng/mL，檢測范圍在0.05～200 ng/mL。

4 結(jié)論與展望

食品安全與人類健康緊密相連，食品質(zhì)量安全也是近年來人民和政府關(guān)注和重視的熱點問題。電化學(xué)分析方法一直是環(huán)境、農(nóng)業(yè)和食品檢測領(lǐng)域的重要分析方法。隨著材料科學(xué)和納米技術(shù)的不斷發(fā)展，電化學(xué)分析方法的性能與效率也在不斷提高。目前，黃曲霉毒素電化學(xué)檢測方法雖然較傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法和色譜法具有很多優(yōu)勢，但仍有很大的發(fā)展空間。

表1 碳納米材料在黃曲霉毒素電化學(xué)分析中的應(yīng)用Table 1 Applications of carbon nanomaterials in analysis of aflatoxins with electrochemical techniques

注：電極材料和檢測方法中的英文縮寫均在正文中有注釋。

(1)檢測通量有待提高。目前大多數(shù)方法只能測定單一組分，這顯然限制了其實際應(yīng)用，發(fā)展可以同時檢測多種黃曲霉毒素或生物毒素的方法，對保障食品安全意義重大。

(2)實用、便攜、可重復(fù)使用、快速的檢測方法及分析裝置還有待進(jìn)一步研究。目前，大部分用于黃曲霉毒素檢測的電化學(xué)傳感裝置仍處于實驗室研究階段，很難像商業(yè)化試劑盒或血糖儀那樣方便快捷的對樣品進(jìn)行實時檢測。同時，大部分建立的黃曲霉毒素分析方法都是基于磷酸緩沖溶液中的毒素，對實際樣品的檢測效果就會受基質(zhì)干擾而大打折扣，或?qū)嵱眯圆粡?qiáng)。因此，改進(jìn)方法的實用性也將是未來科學(xué)研究努力的方向之一。

(3)研發(fā)新檢測模式。現(xiàn)有方法的檢測模式有許多，如識別技術(shù)有免疫方法、適配體技術(shù)、分子印跡等，碳納米材料的功能使用上有利于吸附特性、結(jié)構(gòu)特性、電學(xué)特性、光學(xué)特性等，目前的研究已經(jīng)在多檢測模式融合和碳納米材料的多用途利用方面進(jìn)行了不少大膽的嘗試，相信這也將成為黃曲霉毒素電化學(xué)分析研究下一步的發(fā)展方向。采取多種檢測模式聯(lián)用技術(shù)有望在利用二者或多者間的協(xié)同作用，提升黃曲霉毒素的檢測與分析性能。表1匯總了近年來碳納米材料在黃曲霉毒素電化學(xué)分析中的應(yīng)用情況。

(4)研發(fā)新材料。利用納米材料，特別是碳納米管、石墨烯、納米金和磁性納米粒子等，構(gòu)建復(fù)合材料用于黃曲霉毒素檢測的文獻(xiàn)呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。因此，要想繼續(xù)提升分析檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，還須從材料入手，探索具有更強(qiáng)親和力和分子識別能力的識別材料以及可以放大電化學(xué)信號的信標(biāo)材料。