劉盼盼，鄭鵬程，，龔自明*，馮琳，王雪萍，高士偉，滕靖，葉飛,胡邵德

1(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北省茶葉工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢，430064)2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥，230026)

綠茶是我國產(chǎn)量最大、消費(fèi)量最大、最有優(yōu)勢的茶類。特種綠茶作為綠茶的一類，是通過不同的制作方法及做形，形成的外形獨(dú)具一格、內(nèi)質(zhì)別有風(fēng)韻的名茶[1]。珠形綠茶一般使用一芽二、三葉的鮮葉原料，采用曲毫機(jī)造型的獨(dú)特工藝，所加工出的產(chǎn)品具有顆粒圓結(jié)、色澤綠潤、香高持久、滋味濃爽、湯色清亮、葉底綠明等特點(diǎn)[2]。珠形綠茶的鮮葉原料較成熟，適合推廣機(jī)械化采摘，可大大降低生產(chǎn)成本，是當(dāng)前提倡生產(chǎn)的大眾消費(fèi)型名優(yōu)茶的代表性類型[3]。香氣、滋味及湯色是綠茶茶湯的主要品質(zhì)特征，其中滋味是決定綠茶風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)鍵因子[4]。色澤也是綠茶品質(zhì)的重要評價指標(biāo)之一[5-6]。目前對珠形綠茶的研究多數(shù)集中于茶葉機(jī)械、加工工藝等方面[2,7-8]，少數(shù)涉及品質(zhì)成分分析[9]，可見對構(gòu)成珠形綠茶品質(zhì)特征的感官品質(zhì)、色澤、滋味化學(xué)成分組成及含量的研究尚不系統(tǒng)。

主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)是目前食品領(lǐng)域比較常見的多元統(tǒng)計技術(shù)[10-17]。本研究針對涌溪火青、綠寶石和平水日鑄3個主要珠形綠茶樣品，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法、色差計及分光光度計等常規(guī)方法進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分含量、色差值檢測和分析，結(jié)合多元統(tǒng)計分析技術(shù)，揭示其主要滋味化學(xué)成分含量、色差值在不同產(chǎn)地珠形綠茶樣品中的差異，以期明確珠形綠茶的主要品質(zhì)特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品來自安徽宣城、貴州遵義及浙江紹興的珠形綠茶主產(chǎn)區(qū)，所有樣品的加工均按照珠形綠茶初制工藝進(jìn)行，基本工藝流程為“鮮葉→殺青→揉捻→做形→干燥”，茶樣經(jīng)過粉碎后用鋁箔袋低溫密封儲存。

咖啡堿、沒食子酸(gallic acid, GA) 、沒食子兒茶素(gallocatechin, GC) 、表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC) 、兒茶素(catechin, C) 、表兒茶素(epicatechin, EC) 、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG) 、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate, GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate, ECG) 和兒茶素沒食子酸酯(catechingallate, CG),Sigma公司；乙酸、乙腈、甲醇、KH2PO4等試劑為色譜純；福林酚、AlCl3、氯化亞錫、茚三酮等試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 不同產(chǎn)地珠形綠茶樣品信息Table 1 Information of bead-shaped green tea samples from different places

1.2 儀器設(shè)備

Waters 2695 高效液相色譜、2998 PDA檢測器,美國Waters公司；CM-5色差計，日本柯尼卡美能達(dá)公司；島津UV-2550紫外-可見光分光光度計，日本島津公司；Milli-RO PLUS 30純水機(jī)，法國Millipore公司；Waters Symmetry C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；HHS型恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 感官審評評分

根據(jù)GB/T 23776—2018(茶葉感官審評方法)中的綠茶審評法，由專業(yè)人員對樣品的外形、湯色、香氣、滋味和葉底進(jìn)行感官審評，總分=外形×0.25+湯色×0.10+香氣×0.25+滋味×0.30+葉底×0.10。

1.3.2 容重含量測定

采用量筒法測定茶葉容重。茶葉加料方法選擇自然堆放法，手工加料，使供試材料表面基本和容器刻度線平齊，讀取容積數(shù)值，稱量茶葉質(zhì)量。計算公式如式(1)：

(1)

式中：R，茶葉容重，g/L；G，為茶葉質(zhì)量，g；V為茶葉所占量筒體積，L。

1.3.3 色差測定方法

色差法(亮度L值，紅綠色度a值、黃藍(lán)色度b值、色相b/a值)測定(光源D65，角度4 °)，干茶混勻隨機(jī)取樣，用專用比色皿測定；湯色采取3 g茶葉加150 mL沸純凈水沖泡5 min，過濾后用專用比色皿測定[18]。

1.3.4 化學(xué)成分測定方法

水浸出物含量測定參照GB/T 8305—2013《茶：水浸出物測定》恒溫干燥法；茶多酚含量測定參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢驗(yàn)方法》福林酚法；氨基酸含量測定參照GB/T 8314—2013《茶：游離氨基酸總量的測定》茚三酮比色法；可溶性總糖的測定采用蒽酮-硫酸法[19]；黃酮化合物含量的測定采用三氯化鋁法[19]。

兒茶素、沒食子酸及咖啡堿含量的測定采用高效液相色譜法[20]，流動相為0.2 %乙酸和乙腈，色譜條件：檢測波長為278 nm，流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，流動相梯度洗脫。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次，采用SPSS 22.0和SIMCA 13.0軟件進(jìn)行顯著性分析、PCA與PLS-DA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地珠形綠茶感官品質(zhì)分析

3個產(chǎn)地珠形綠茶感官審評結(jié)果如表2所示，涌溪火青總分為85.5～90.2，大部分樣品呈顆粒狀、茶湯嫩綠、有栗香、滋味較甘醇，總分最高；綠寶石總分為86.4～87.6，大部分樣品呈顆粒狀、湯色綠、香氣清高、微有栗香或花香、滋味尚濃醇；平水日鑄總分為84.1～87.5，大部分樣品稍呈顆粒狀、湯色嫩黃或黃綠、以清香為主、帶悶、滋味較濃醇。

2.2 不同產(chǎn)地珠形綠茶主要化學(xué)成分及色差分析

茶葉容重是反映商品茶物理性狀的一個重要指標(biāo)。由表3可知，珠形綠茶平均容重從大到小依次為：綠寶石、涌溪火青和平水日鑄，平水日鑄在外形審評中稍呈顆粒狀，緊結(jié)度低于兩類珠形綠茶，與容重測定結(jié)果一致，容重差異可能與其做形工藝參數(shù)變化有關(guān)。3個產(chǎn)地綠茶的干茶與茶湯亮度L值差異較小，綠寶石的干茶和茶湯色差a值最小、綠度最好，涌溪火青的干茶和茶湯色差b值最小、藍(lán)度較好，干茶和茶湯色相b/a值分別以涌溪火青和綠寶石最高。

不同產(chǎn)地珠形綠茶主要滋味化學(xué)成分如表3所示，涌溪火青、綠寶石和平水日鑄的水浸出物總量較為接近，其平均含量分別為43.87 %、43.24 %和42.75 %；游離氨基酸總量以綠寶石略低于其他2個產(chǎn)地珠形綠茶；涌溪火青和綠寶石的茶多酚、兒茶素含量相近，都顯著高于平水日鑄；綠寶石的可溶性糖含量低于其他2個產(chǎn)地珠形綠茶，而黃酮含量則較高；涌溪火青、綠寶石和平水日鑄的咖啡堿較為接近，其平均含量分別為3.80 %、3.51 %和3.40 %。涌溪火青和平水日鑄的滋味鮮爽度、甘甜度明顯高于綠寶石，與其高含量的氨基酸和可溶性糖相關(guān)。兒茶素組成方面，EGCG、GCG、ECG、EGC的含量較高且以平水日鑄顯著低于其他2個產(chǎn)地。

表2 不同產(chǎn)地珠形綠茶感官審評結(jié)果Table 2 Sensory evaluation of bead-shaped green tea samples produced from different areas

綠茶色澤特征為清湯綠葉，殺青是形成該色澤特征的關(guān)鍵工序，有研究表明，微波殺青和汽熱殺青的色澤較優(yōu)[21]。對珠形綠茶而言，做形溫度及時間對其色澤的影響也很大。綠茶的滋味特征主要為苦、澀、鮮、甜，基本沒有酸、咸味[22]。兒茶素是綠茶茶湯中的多酚類的主體物質(zhì)，表型兒茶素約占兒茶素總量的70 %，以EGCG的含量最高，主要呈現(xiàn)出苦味和澀味，其中EGCG的苦味強(qiáng)于澀味，EGC的澀味強(qiáng)于苦味，ECG的苦澀味相當(dāng)，少數(shù)人甚至覺得EC具有鮮味和咸味[23-26]。茶葉滋味、色澤的形成主要受茶樹品種、栽培環(huán)境、采摘季節(jié)、加工工藝等因素影響，促使茶葉化學(xué)物質(zhì)的組成和含量存在差異，從而產(chǎn)生不同類型的風(fēng)味品質(zhì)。

表3 不同產(chǎn)地珠形綠茶色差及化學(xué)成分含量Table 3 Chromatic aberration and contents of chemical components in bead-shaped green teas from different areas

注：表中數(shù)據(jù)為3個平均值，同行中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。表中%為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 基于多元統(tǒng)計分析不同產(chǎn)地珠形茶化學(xué)成分與色差

由于茶葉成分種類多、成分復(fù)雜，且受茶樹品種、原產(chǎn)地及加工條件等多方面影響，很難通過簡單的數(shù)據(jù)分析獲得有效的變量。多元統(tǒng)計分析是一種綜合分析方法，能夠在多個對象和多個指標(biāo)互相關(guān)聯(lián)的情況下分析目標(biāo)樣品的統(tǒng)計規(guī)律，主要研究客觀事物中多個變量之間相互依賴的統(tǒng)計規(guī)律性[27]。其中PCA是常見的統(tǒng)計學(xué)分析手段，首先本研究基于不同產(chǎn)地珠形綠茶色澤與滋味成分的含量建立了相應(yīng)的PCA模型，如圖1-A所示，統(tǒng)計分析結(jié)果表明，綠茶樣品以產(chǎn)地為指定變量可獲得較好聚類效果。

對3個主產(chǎn)地珠形綠茶滋味化學(xué)成分及色差等進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖1-A、圖1-B、表4所示，第1主成分方差貢獻(xiàn)率為44.597 %，總兒茶素、b/a(茶湯)的貢獻(xiàn)率最大，對應(yīng)的特征向量為0.968、0.938，這些成分對茶湯滋味的苦澀味和厚度，茶湯的色澤有重要貢獻(xiàn)，因此第1主成分主要反映珠形綠茶的苦澀味及茶湯色差；第2主成分方差貢獻(xiàn)率為17.696%，干茶色差a值和茶湯色差a值的貢獻(xiàn)率最大，對應(yīng)的特征向量為0.876和0.664，因此第2主成分主要反映珠形綠茶干茶和茶湯的色澤；第3主成分方差貢獻(xiàn)率為7.791%，可溶性糖的貢獻(xiàn)率最大，對應(yīng)的特征向量為0.659，可溶性糖對茶湯的甜度有影響，因此第3主成分主要反映珠形綠茶茶湯的甜味；第4主成分方差貢獻(xiàn)率為5.872%，EC的貢獻(xiàn)率最大，對應(yīng)的特征向量為0.384，因此第4主成分主要反映珠形綠茶茶湯的苦澀味；第5主成分方差貢獻(xiàn)率為5.265%，C的貢獻(xiàn)率最大，對應(yīng)的特征向量為0.488，因此第5主成分主要反映珠形綠茶茶湯的苦澀味；5個主成分方差累計貢獻(xiàn)率達(dá)到81.222 %，可基本反映總體情況。因子載荷圖可以反映每一個變量在得分圖上的貢獻(xiàn)，以第1、第2主成分作PCA載荷圖可以直觀看出，變量17(總兒茶素)、變量25(b/a(茶湯))在第1主成分上貢獻(xiàn)率最高，變量19(干茶色差a值)、變量23(茶湯色差a值)在第2主成分上貢獻(xiàn)率最高(圖1-B)。

PLS-DA為有監(jiān)督的分析，人為加入了分組變量，可彌補(bǔ)PCA方法的不足，強(qiáng)化組間的差異，因此具有高效的鑒別能力，可進(jìn)一步對特征化合物進(jìn)行發(fā)現(xiàn)和篩選[28]。本研究采用SIMCA-P 13.0軟件對綠茶檢測結(jié)果進(jìn)行分析，基于珠形綠茶色澤與主要滋味成分的含量建立了PLS-DA模型，通過PLS-DA模型更好地區(qū)分了3個產(chǎn)地的珠形綠茶樣品。將模型建立時定義的分類Y矩陣的變量隨機(jī)排列20次，得到隨機(jī)的不同相應(yīng)Q2值作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，R2=0.202，Q2=-0.608，Q2負(fù)值表明該P(yáng)LS-DA模型可靠，未存在過擬合現(xiàn)象，可以用于各自類別的判別分析。PLS-DA變量重要性因子(variable important for the projection，VIP)值可以量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻(xiàn)，VIP值越大，變量在不同產(chǎn)地間差異越明顯[29]。從化學(xué)成分中鑒定出影響珠形綠茶品質(zhì)的8種關(guān)鍵成分指標(biāo)(VIP>1.0，SE<0.5) (圖2-D)，它們分別是a(干茶)、b/a(干茶)、b(茶湯)、a(茶湯)、EGCG、總兒茶素(catechins)、CG和EGC，可以作為區(qū)別3個產(chǎn)地珠形綠茶的標(biāo)志物。

表4 主成分分析的特征值Table 4 Eigenvalues of principal component analysis

表5 主成分分析的特征向量Table 5 Eigenvectors of principal component analysis

A-PCA 得分圖；B- PCA 載荷圖；C-PLS-DA 得分圖；D-VIP>1關(guān)鍵成分；Y-涌溪火青；L-綠寶石；P-平水日鑄圖1 不同產(chǎn)地珠形綠茶化學(xué)成分PCA得分圖、PCA載荷圖、PLS-DA得分圖及其VIP值Fig.1 Score plot of PCA and PLS-DA, PLS-DA model of validate components, VIP values inbead-shaped green teas from different different areas

3 結(jié)論

3個產(chǎn)地珠形綠茶中涌溪火青大部分樣品呈顆粒狀、茶湯嫩綠、有栗香、滋味較甘醇，總分最高，綠寶石大部分樣品呈顆粒狀、湯色綠、香氣清高、微有栗香或花香、滋味尚濃醇，平水日鑄大部分樣品稍呈顆粒狀、湯色嫩黃或黃綠、以清香為主、帶悶、滋味較濃醇；綠寶石的容重最大、干茶色差最好，涌溪火青和綠寶石的茶多酚、兒茶素含量相近，都顯著高于平水日鑄，綠寶石的可溶性糖含量顯著低于其他產(chǎn)地，而黃酮總量顯著高于其他產(chǎn)地，3個產(chǎn)地綠茶水浸出物、氨基酸、咖啡堿的含量無顯著差異(P<0.05)。在主成分分析中，提取了PC1和PC2兩個主成分，解釋了不同珠形綠茶特征變量62.293%的方差信息，不同產(chǎn)地珠形綠茶區(qū)域區(qū)分相對明顯，可視化效果直觀。利用偏最小二乘判別分析法建立珠形綠茶相關(guān)模型，得出變量重要性(VIP)圖且得出相關(guān)指標(biāo)8種，分別是a(干茶)、b/a(干茶)、b(茶湯)、a(茶湯)、EGCG、總兒茶素、CG和EGC，對這些指標(biāo)的研究將會對珠形綠茶差異特征分析提供有利的支持。