邱倩 楊松 陳勇 徐小明 楊再興

目前，化療藥物是治療肺結(jié)核的主要方法[1]，但藥物引起的肝腎功能損傷發(fā)生率較高，并且抗結(jié)核藥物的不良反應或引起其他并發(fā)癥成為患者漏服或終止治療的主要原因，增加了耐藥結(jié)核病的發(fā)生率，是目前抗結(jié)核治療亟需解決的問題之一。硫異維甲類化合物A2(sulfur heteroarotinoid A2，SHetA2)是新合成的維生素A類似物。目前，發(fā)現(xiàn)其可選擇性靶向腫瘤細胞發(fā)揮抗癌抑癌活性，而對正常細胞無影響[2]。而SHetA2對MTB感染有無影響未見詳細報道。因此，筆者探討SHetA2在體內(nèi)外對MTB的治療效果，驗證其有無抗結(jié)核作用，為臨床應用提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、實驗藥品及菌株

SHetA2由美國國家癌癥研究所藥物合成和化學研究室提供。SHetA2使用二氯甲烷溶解，使用前用蒸餾水配成所需濃度溶液備用。異煙肼片(北京市永康藥業(yè)有限公司；批號：H11020585；1 mg/片)研粉，加生理鹽水稀釋，配成所需濃度的混懸液備用。MTB標準菌株H37Rv(ATCC25618)由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結(jié)核病實驗室保藏并提供。

二、實驗動物

無特定病原體(SPF)級昆明小鼠76只，雌雄隨機，6周齡，體質(zhì)量20～25 g，平均(23.36±1.81) g，均由第三軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。所有小鼠均行卡介菌純蛋白衍生物(BCG-PPD)皮膚試驗，觀察72 h，皮試結(jié)果為陰性者入選(76只均陰性)。所有實驗均通過重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心動物委員會批準同意。

三、實驗方法

1.建立小鼠肺結(jié)核模型：采用霧化吸入感染裝置構(gòu)建肺結(jié)核小鼠動物模型。霧化吸入感染裝置為美國Glas-Col公司制造，型號為099CA-4212。根據(jù)文獻[3-4]所描述的方法，采用MTB標準菌株H37Rv [106菌落形成單位(CFU)]對76只小鼠進行吸入感染實驗。感染后將小鼠轉(zhuǎn)移至感染實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，7周后采集小鼠靜脈血2 ml，測定機體內(nèi)的MTB。對于機體內(nèi)含有MTB，且影像學檢查肺部存在明顯的病灶部位視為建模成功。共有62只小鼠建模成功，為樣本量統(tǒng)一，納入60只。采用數(shù)字表法隨機將實驗成功建模的肺結(jié)核小鼠分為對照組、異煙肼組、SHetA2組，每組20 只。

2.MTB培養(yǎng)：將MTB標準菌株H37Rv在7H9培養(yǎng)液內(nèi)37 ℃培養(yǎng)4周后收集細菌。

3.最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)測定：采用試管法，將藥物SHetA2(2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml)分別加入蘇通培養(yǎng)基內(nèi)后，加入等量的菌液(1 mg/ml，每支接種0.1 ml，含106CFU細菌)，于37 ℃培養(yǎng)2周后, 每支吸0.1 ml轉(zhuǎn)種于2支改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基斜面，同時設(shè)空白對照管。在含藥蘇通培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)2周抑制細菌生長的最小濃度即為MIC。

4.藥物治療：(1)異煙肼組：給予同體積的異煙肼灌胃。參照文獻[5]，對肺結(jié)核給予常規(guī)異煙肼(5 mg·kg-1·d-1)治療，以正常成人體質(zhì)量70 kg，小鼠體質(zhì)量20 g，按體表面積比(0.0026)等效劑量進行換算給藥，小鼠給藥量為45 mg·kg-1·d-1；每日灌胃1次；(2)SHetA2組：給予同體積的SHetA2混懸液(20 mg·kg-1·d-1)灌胃，每日灌胃2次；(3)對照組：給予同體積的生理鹽水灌胃，每日灌胃1次。以上3組均于建模成功后給藥，連續(xù)灌胃45 d。

5.檢測指標：(1)體征及體質(zhì)量變化：觀察3組小鼠治療45 d后體征(精神狀態(tài)、毛色、飲食、尿便、活動)的變化和體質(zhì)量變化情況。(2)肺組織細菌載荷量計數(shù)和HE染色：在最后一次給藥后24 h處死小鼠，立刻解剖，取小鼠肺臟，肉眼觀察肺組織有無結(jié)節(jié)、水腫、萎縮等病變，病變的嚴重程度及范圍。然后將小鼠左肺組織剪碎，置于無菌組織勻漿器中，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)研磨勻漿，視為原液，連續(xù)6次10倍稀釋，取0.1 ml勻漿稀釋液接種于直徑6 cm改良羅氏培養(yǎng)平板，每個稀釋度做2個復板，37 ℃培養(yǎng)，4周后觀察MTB的生長情況，計算菌落數(shù)，結(jié)果經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換(lg10)后表示。同時將各剩余組織置于10%福爾馬林中固定并做切片進行HE染色，光鏡下觀察，分為4級：無、輕、中、重度(表1)。

表1 肺臟病變(HE染色)分級標準

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、SHetA2體外對MTB生長的影響

將不同濃度的藥物SHetA2 (2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml)分別加入含MTB的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)一定時間后，發(fā)現(xiàn)SHetA2可抑制MTB的生長，具有濃度依賴性，其MIC為10 μg/ml。

二、SHetA2體內(nèi)對結(jié)核感染小鼠的作用

1.體征及體質(zhì)量變化：SHetA2組和異煙肼組小鼠治療后精神狀態(tài)佳、飲食及尿便正常，未出現(xiàn)死亡。對照組小鼠偶有咯血，毛色欠光澤，精神萎靡，活動減少。三組小鼠治療前體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義；治療45 d后，SHetA2組和異煙肼組小鼠體質(zhì)量高于對照組，SHetA2組和異煙肼組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(q=0.10，P=0.998)，見表2。

表2 各組小鼠治療前后體質(zhì)量變化情況

注a：與對照組治療45 d后比較，q=3.44，P=0.047；b：與對照組治療45 d后比較，q=3.53，P=0.040

2.小鼠肺臟觀察：對照組小鼠肺臟增大，膨脹充血，表面均密布粟粒樣結(jié)節(jié)或散在5～10個大小不等結(jié)節(jié)，直徑0.1～0.5 cm，觸之較硬，切開存在砂礫感。異煙肼組和SHetA2組小鼠肺臟略有增大，呈鮮紅色或暗紅色，肺臟多散在3～6個白色或灰白色結(jié)節(jié)，直徑0.1～0.3 cm，或偶見密布粟粒樣結(jié)節(jié)。

HE染色后觀察，對照組肺組織病變以滲出為主，組織結(jié)構(gòu)破壞，白細胞聚集，有大量炎性細胞浸潤及肺實變，肺臟可見典型結(jié)核結(jié)節(jié)，炎癥反應嚴重；異煙肼組和SHetA2組均以少量滲出或少量增生性病變?yōu)橹?，組織結(jié)構(gòu)部分破壞，見少量炎癥細胞浸潤。對照組小鼠肺臟炎癥重度的構(gòu)成比明顯高于異煙肼組和SHetA2組(χ2=32.18，P<0.01)，見表3。

表3 各組小鼠肺臟病理組織學檢查病變分級情況

3.小鼠肺臟感染細菌數(shù)量：菌落計數(shù)結(jié)果(lg10 CFU/ml)顯示，對照組、異煙肼組、SHetA2組小鼠肺臟感染細菌數(shù)量分別為7.01±1.23、2.59±0.87、2.25±0.94，對照組明顯高于異煙肼組和SHetA2組，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.71，P=0.002)；而異煙肼組與SHetA2組比較，差異無統(tǒng)計學意義(q=0.33，P=0.970)。

討 論

MTB是結(jié)核病的致病菌，主要通過呼吸道傳播，可侵襲很多器官，其中以肺部感染最為常見。目前，肺結(jié)核疫情形勢嚴峻，傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥物治療周期長，不良反應大；因此，國內(nèi)外加快了對新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)，取得了一些成果，出現(xiàn)了一些新型的、不同于傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物作用機制的藥物，如貝達喹啉、德拉馬尼、SQ109、PA-824、TBA-354、BTZ043等[6]，但這些新藥仍有嚴重不良反應，限制了其臨床應用[7]。

異維甲類化合物(Hets)是一類新的有抗癌活性的小分子藥物，最初源自于維生素A類似物的維甲類化合物，但它在維甲類化合物的環(huán)中插入了一個雜原子，稱之為異維甲類化合物。維甲類化合物的毒性是天然維生素A的1000倍以上，而雜原子可使維甲類化合物的毒性降回原來的1/1000以下，達到和天然維生素A相似的水平[8]。通過構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，Hets有體內(nèi)抗腫瘤活性[9]。Hets可通過兩個原子(富有彈性的尿素氮或硫脲)連接元件替換，生成撓性異維甲類化合物(flexible heteroarotinoid，F(xiàn)lex-Hets)。和維甲類化合物及普通的Hets一樣，F(xiàn)lex-Hets可抑制細胞生長和誘導分化。不同的是，F(xiàn)lex-Hets還可以不依賴核視黃酸受體的機制誘導細胞凋亡[10]。因此，F(xiàn)lex-Hets不引起其他維甲類化合物的不良反應，如皮膚刺激性和致畸性[11]。

Flex-Het包含了一個硫雜原子、一個硫脲鏈接元件和一個NO2成分。作為Flex-Het里一個新合成的化合物，SHetA2有在所有的癌細胞系中最強和最有潛力的生長抑制活性，同時基本不影響正常細胞的分化。因此，SHetA2被用于癌癥治療和預防領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，SHetA2可在體內(nèi)外抑制腎癌、卵巢癌、肺癌等發(fā)生和發(fā)展[12-13]。但至今未見確切報道其在肺結(jié)核方面的應用。目前，僅Ibrahim等[14]在2016年發(fā)現(xiàn)SHetA2在體外表現(xiàn)為對MTB的生長有抑制作用，但至今未見具體直接的數(shù)據(jù)報道。

筆者采用霧化吸入感染法建立肺結(jié)核小鼠模型，通過靜脈血測定和影像學檢查評價造模，結(jié)果表明，本次實驗肺結(jié)核小鼠模型造模成功。對肺結(jié)核小鼠模型施以不同的處理(生理鹽水、異煙肼、SHetA2)后，與對照組比較，異煙肼、SHetA2治療肺結(jié)核小鼠后，其一般體征及客觀指標等方面皆有不同程度的改善：(1)一般體征：體質(zhì)量增長正常，皮毛光滑潤澤，進食正常，精神狀況良好，活動度佳。(2)肺臟組織形態(tài)：肉眼觀察肺組織結(jié)核結(jié)節(jié)較少；光鏡下治療組肺臟炎癥反應較對照組明顯減輕，而SHetA2組與異煙肼組比較，無明顯差別。并且，相對于異煙肼常見的胃腸道反應、周圍神經(jīng)炎、肝損傷、過敏反應、血液系統(tǒng)癥狀、內(nèi)分泌失調(diào)等不良反應，SHetA2的不良反應極小，并且對正常細胞無害[15]，表明SHetA2或可成為最有潛力的抗結(jié)核化學藥物的候選。

Zhang等[16]通過高效液相色譜法/紫外線(high performance liquid chromatography/ultraviolet，HPLC/UV)方法研究了SHetA2在小鼠體內(nèi)的藥代動力學，發(fā)現(xiàn)標準曲線在25 nmol/L和2500 nmol/L 之間呈線性關(guān)系，SHetA2被發(fā)現(xiàn)在4 ℃ 條件下在小鼠血漿中是穩(wěn)定的，24 h后無明顯丟失。然而，在37 ℃條件下，SHetA2的濃度呈單指數(shù)下降，其半衰期為12.7 h；而以20 mg/kg或60 mg/kg 的劑量口服，SHetA2口服的生物利用度分別為15%和19%。因此，筆者選用20 mg/kg作為口服的劑量，以每日灌胃2次的治療頻次進行研究。眾所周知，MTB在肺泡巨噬細胞內(nèi)存活和復制。研究發(fā)現(xiàn)，SHetA2有巨噬細胞靶向作用[14]。因此，筆者認為SHetA2通過靶向巨噬細胞發(fā)揮抗結(jié)核的作用，但具體機制不明，下一步我們將深入研究。

綜上，SHetA2治療肺結(jié)核小鼠模型，能明顯改善小鼠的一般體征及組織病變，減輕肺臟炎癥反應，在體內(nèi)外抑制MTB的生長。其抗結(jié)核的作用和異煙肼一致，因其極小的不良反應，SHetA2或可成為有潛力的抗結(jié)核化學藥物的候選。