江麗娜 穆成 孫蕊 王志銳 戴文汐 王春花

結核病作為單一感染源的全球十大致死疾病之一，目前因其死亡的患者例數(shù)已經(jīng)超過艾滋病[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO) 報告指出，2017年全球大概有1000萬例結核病患者，單耐利福平患者55.8萬例，其中82%為耐多藥肺結核(MDR-PTB)，約50%的MDR-PTB患者集中在印度(24%)、中國(13%)、俄羅斯(10%)[1]。MDR-TB已經(jīng)迅速發(fā)展為全球重要的公共健康問題，特別是在發(fā)展中國家，給傳染病的預防和控制帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

及早發(fā)現(xiàn)和治療MDR-TB對有效控制及遏制結核病的傳播和預防起著重要的作用[2]。一直以來，表型藥物敏感性試驗(簡稱“比例法藥敏試驗”)是抗結核藥物耐藥性檢測的金標準，但是長達幾周至2個月的檢測時間嚴重影響了臨床診斷和治療。故而基因型分子藥敏試驗檢測技術快速發(fā)展起來。2008年，WHO推薦可以應用分子線性探針技術作為快速檢測MDR-TB的手段[3]。GenoType?MTBDRplus assay是德國Hain公司研發(fā)的已被臨床廣泛應用于檢測結核分枝桿菌復合群及其對利福平和異煙肼耐藥性，以及識別耐藥相關基因突變位點的分子生物學技術[4]。2012年Hain公司在原有基礎上改進研發(fā)了GenoType MTBDRplus VER 2.0(簡稱“GenoType 2.0”)，較GenoType?MTBDRplus assay具有更高的敏感度和特異度，在臨床及全球結核病疫情嚴重地區(qū)被大力推廣[3-4]。為了解GenoType 2.0的檢測效能，天津結核病控制中心參比實驗室使用GenoType 2.0試劑盒檢測培養(yǎng)陽性菌株，并與比例法藥敏試驗進行檢測效能比較，為該技術的應用提供一定參考。

材料和方法

一、研究材料

1.樣本來源：收集2017年4月至2019年4月天津市結核病控制中心參比實驗室中疑似肺結核患者的痰標本共6315份，對其中412份痰涂片陽性標本行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，排除39份培養(yǎng)陰性標本；對373株培養(yǎng)陽性菌株進行菌種鑒定，排除23株經(jīng)鑒定為非結核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)、1株培養(yǎng)陽性但GenoType 2.0無法判讀的菌株，將鑒定為結核分枝桿菌(MTB)的349株菌株作為研究對象，分別采用比例法藥敏試驗和GenoType 2.0檢測其對利福平、異煙肼的耐藥性，比較比例法藥敏試驗、GenoType 2.0，以及GenoType 2.0+比例法檢測情況，其中GenoType 2.0+比例法的耐藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計以其中任一方法耐藥即判定為“耐藥”。并以比例法為標準，分析GenoType 2.0的檢測效能和GenoType 2.0檢測的突變基因分布情況。

2.試劑及設備：GenoType 2.0試劑盒(德國HAIN Lifescience公司)；BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術有限公司)；線性探針耐多藥檢測設備GTblot-20全自動雜交儀(德國HAIN Lifescience公司)；超聲儀D-78224(德國Elma 公司)；基因擴增儀Ag-22331(德國 Eppendorf 公司)；低溫離心機5430R(德國Eppendorf公司)；恒溫金屬浴D-91052(德國PEQLAB公司)。

二、菌種鑒定和比例法藥敏試驗

使用硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基對373株培養(yǎng)陽性的菌株進行菌種鑒定。根據(jù)《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[5]，按照實驗室標準化程序，分別采用含利福平40 μg/ml、異煙肼0.2 μg/ml的培養(yǎng)基按照WHO推薦的比例法藥敏試驗進行菌株耐藥性檢測及結果判定[6-7]。

三、GenoType 2.0檢測

本實驗基于多重聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，擴增產(chǎn)物通過反向雜交技術與預先固化在試紙條上的特異性探針雜交，通過雜交條帶的顯色情況來判定MTB對利福平和異煙肼的耐藥性?；诰€性探針方法條帶技術，嚴格按照說明書進行操作，步驟包括結核分枝桿菌復合群的基因組提取、生物素標記引物的PCR擴增、反向雜交三部分。實驗檢測的3個突變基因分別為：rpoB為利福平耐藥；inhA為異煙肼低水平耐藥；katG為異煙肼高水平耐藥，在雜交帶上3個基因的野生型和突變型均可以體現(xiàn)。每個標本需要1個探針試條，每個探針試條有27個反應區(qū)，包括標記物質(zhì)量控制(簡稱“質(zhì)控”，CC)、 擴增質(zhì)控(AC)、 結核分枝桿菌復合群(TUB)、野生型和突變型探針。

1.核酸提取與PCR擴增：DNA提取試劑盒GenoLyse?kit包括裂解液(LA-LYS) 與中和緩沖液(A-NB)。每個菌株取1平環(huán)菌落放入含100 μl裂解液的1.5 ml離心管中，振蕩混勻。將懸浮液 放于95 ℃金屬浴滅活5 min，短暫離心后(離心半徑為10 cm，3000 r/min 離心30 s)，加入100 μl的中和緩沖液，振蕩5 s后混勻。再采用離心半徑為10 cm，14 000 r/min 離心5 min 后轉移上清至另一1.5 ml離心管，用于擴增。擴增體系50 μl：由10 μl的AM-A 試劑(包括10×PCR緩沖液，4種核苷酸，DNA擴增酶)、35 μl的AM-B試劑(包括MgCl2，生物素標記的引物和染液)和5 μl提取的基因組模板組成。擴增條件：95 ℃ 15 min，1個循環(huán)；95 ℃ 30 s，65 ℃ 2 min，10個循環(huán)；95 ℃ 25 s，50 ℃ 40 s，70 ℃ 40 s，20個循環(huán)；70 ℃ 8 min，1個循環(huán)；4 ℃ 保存。

2.反向雜交檢測：雜交反應在預熱的GTblot-20全自動雜交儀上進行。使用前，45 ℃預熱雜交緩沖液(HYB)和嚴格漂洗液(STR)直至溶液沒有結晶。分別取20 μl PCR產(chǎn)物與20 μl分離試劑混合，加入雜交盤，室溫變性5 min。分別謹慎加入帶有探針的測試條，并將雜交盤放入已經(jīng)預熱的GTblot-20全自動雜交儀，進行雜交及顯色。其余步驟嚴格按照說明書進行。

3.結果判讀：按照使用手冊判讀結果，即標記物質(zhì)控條帶(CC)顯色，表示標記物結合并與底物反應有效；擴增質(zhì)控條帶(AC)顯色，可排除提取過程、擴增和擴增抑制劑引起的錯誤；TUB顯色判讀為結核分枝桿菌復合群，未顯色則為未檢測到MTB。所有野生探針(利福平有8個野生探針；異煙肼katG基因有1個野生探針，inhA基因有2個野生探針)均顯色且所有突變探針均未顯色判讀為敏感；任一野生探針未顯色或任一突變探針顯色判讀為耐藥。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.5軟件對結果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。不同方法檢測MTB耐藥性結果的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。以比例法檢測結果為標準，計算GenoType 2.0的檢測效能，即敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率、Kappa值。其中Kappa值<0.40表示一致性差，0.400.75表示一致性好。

結 果

一、GenoType 2.0和比例法藥敏試驗檢測結果分析

采用GenoType 2.0和比例法藥敏試驗分別對349株MTB臨床分離株進行利福平和異煙肼的耐藥性檢測，并統(tǒng)計兩種方法聯(lián)合檢測情況。結果顯示，GenoType 2.0、比例法藥敏試驗和GenoType 2.0+比例法藥敏試驗檢測菌株對利福平和異煙肼在敏感、單耐、耐利福平+異煙肼(簡稱“耐兩藥”)檢出率間的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，見表1。

二、GenoType 2.0對利福平和異煙肼的耐藥性檢測效能

以比例法藥敏試驗為參考標準，GenoType 2.0對利福平和異煙肼耐藥性檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率、Kappa值見表2。其中，2種技術對利福平和異煙肼耐藥性檢測結果進行一致性檢驗，Kappa值分別為0.91、0.97，均有較好的一致性。對其中GenoType 2.0檢測利福平為敏感而比例法檢測為耐藥的4株菌株經(jīng)GeneXpert MTB/RIF重復試驗后，結果仍然為對利福平敏感，但未進行基因型鑒定。

表1 不同藥敏試驗方法檢測349株MTB菌株對利福平和異煙肼的耐藥情況 [株(檢出率，%)]

注在敏感、單耐、耐兩藥菌株間的分布比較上，a為GenoType 2.0與比例法比較，b為GenoType 2.0與GenoType 2.0+比例法的比較，c為比例法與GenoType 2.0+比例法的比較；GenoType 2.0+比例法的耐藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計以其中任一方法耐藥性即判定為“耐藥”，其中單耐利福平菌株在GenoType 2.0檢測中為單耐藥，而在比例法檢測中為耐兩藥，統(tǒng)計時納入“耐兩藥”組中

表2 以比例法藥敏試驗為參考標準評價GenoType 2.0對利福平、異煙肼耐藥性檢測的效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/患者總例數(shù)×100%

三、GenoType 2.0檢測利福平和異煙肼耐藥性相關的突變基因

利福平和異煙肼耐藥性相關的突變基因發(fā)生頻率的分布見表3。在47株對利福平耐藥的菌株中，25株(53.19%)野生型(WT)8條帶缺失(530～533密碼子)，且rpoBMUT3探針顯色；19株(40.43%)rpoB位點突變發(fā)生在WT 1、2、3、4、7中，其中發(fā)生在WT1有2株、WT2與3有2株、WT3與4有7株、WT7有8株，且相關突變探針顯色；1株(2.12%)僅出現(xiàn)WT2條帶的缺失，判讀為對利福平耐藥；2株(4.26%)僅出現(xiàn)WT8條帶缺失，且未有相關突變探針顯色，判讀為對利福平耐藥。在70株異煙肼耐藥菌株中，katG高濃度耐藥突變共51株(72.86%)，其中以S315T1突變?yōu)橹?47株)，占katG突變總數(shù)的92.16%；inhA低濃度耐藥突變共19株(27.14%)，其中以C15T位點突變?yōu)橹?17株)，占總數(shù)的89.47%。GenoType 2.0 技術檢測的部分條帶見圖1。

討 論

耐藥結核病的出現(xiàn)不僅給結核病的感染控制增加了難度，而且也嚴重威脅著人們的健康。因此，及時準確檢測出MTB的耐藥性，不僅有助于及早發(fā)現(xiàn)MDR-TB患者，有效控制結核病的傳播，也可為患者的治療用藥提供依據(jù)。傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗因其能給出最準確的藥敏試驗結果而成為一直以來的檢測金標準，但由于其檢測周期過長，需2～3個月的時間，明顯延誤患者的診斷及治療。自2008年開始，WHO向全世界推薦德國Hain公司生產(chǎn)的GenoType 1.0代耐多藥結核分子檢測方法(GenoType?MTBDRplus assay)，并在臨床上廣泛推薦使用，但是，這種方法只能檢測培養(yǎng)陽性或者涂片陽性的標本，且敏感度和特異度都不是很高[8]；至2012年，Hain公司對GenoType 1.0代試劑盒進行了改進，推出了可應用于涂片陰性的標本、且檢測周期短(24 h即可完成檢測)、敏感度和特異度大幅提高的Hain 2代試劑盒(GenoType 2.0)。

表3 GenoType 2.0檢測MTB對利福平與異煙肼耐藥性相關突變基因的分布

注“-”指未檢出

從左到右：條帶1，陰性對照(水)；條帶2，陽性對照(MTB標準菌株，ATCC27294)；條帶3，inhA突變低水平單耐異煙肼；條帶4，非結核分枝桿菌；條帶5，單耐利福平；條帶6，耐低水平異煙肼的耐多藥肺結核；條帶7，MTB并對利福平和異煙肼敏感；條帶8，單耐利福平；條帶9，MTB并對利福平和異煙肼敏感；條帶10，katG突變耐高水平異煙肼的耐多藥肺結核；條帶11，GenoType 2.0檢測自帶比對條圖1 GenoType 2.0 檢測的帶型及基因型的部分條帶展示

從2012年GenoType 2.0問世以來，這種改進的方法在國外被陸續(xù)采用，而我國還沒有在臨床上大范圍地推廣。目前為止，只有上海一家醫(yī)院采用了此方法，并分析了其在臨床應用中的價值。該報道中，對利福平耐藥性檢測的敏感度為100.00%、特異度為97.30%，對異煙肼耐藥性檢測的敏感度為84.44%、特異度為96.94%[9]；而在本實驗中，對利福平耐藥性檢測的敏感度(91.67%)低于上述研究，也低于其他的研究報道[3,10](認為GenoType 2.0對利福平和異煙肼耐藥性檢測的敏感度和特異度均在95%～100%之間)，而對利福平耐藥性檢測的特異度(99.00%)，對異煙肼耐藥性檢測的敏感度(95.89%)和特異度(100.00%)均高于上海的研究，但與文獻[3,11]一致。認為本研究對利福平耐藥性檢測的敏感度低，可能與有4株GenoType 2.0技術檢測為敏感而比例法藥敏試驗結果為耐藥的菌株，對利福平耐藥的基因突變發(fā)生在GenoType MTBDRplus檢測的基因之外，導致本檢測方法未能檢測到有關。而且，這4株菌株經(jīng)GeneXpert MTB/RIF重復試驗后，結果仍然為對利福平敏感，進一步證明4例菌株對利福平的耐藥基因突變發(fā)生在GenoType 2.0 檢測范圍以外。且認為不能檢測到的基因突變可能與同一國家不同地區(qū)流行菌株基因型的差異有關，但本研究未能進一步驗證菌株基因型。另外，上海的報道是以痰涂片陽性為納入標本，而本研究則以培陽菌株為實驗標本，使得本實驗對利福平和異煙肼耐藥性檢測的特異度均很高。最新的一篇報道指出，在125株MDR-MTB中，有38株(30.4%)菌株的利福平耐藥位點都不在利福平耐藥核心區(qū)域內(nèi)，如果使用目前利福平核心區(qū)域的方法檢測就會遺漏約1/3的利福平耐藥菌株[11]，說明分子生物學檢測耐藥基因的范圍不僅需要進一步擴大，而且也說明比例法藥敏試驗仍然是檢測MTB耐藥表型的金標準，并不能被分子生物學方法完全替代。

本研究結果顯示，對于利福平和異煙肼的耐藥菌株，聯(lián)合檢測(以任一方法耐藥即判定為耐藥)的總耐藥檢出率(13.75%和20.34%)高于GenoType 2.0(13.47%和20.05%)和比例法(12.03%和19.77%)，說明聯(lián)合檢測能提高耐藥性檢測的陽性率，但三組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義，且Kappa值較高，說明兩種方法對于培陽患者耐藥菌株的檢測結果具有高度一致性，也進一步說明了GenoType 2.0 技術可以獨立作為臨床診斷的標準[12]；但考慮到GenoType 2.0技術僅能檢測到最常見的katG/inhA和rpoB基因突變，對其他基因的沉默突變或罕見突變不能準確判定，故目前臨床診治中仍進行聯(lián)合檢測，以避免漏診，有利于耐藥結核病的防控和患者及時診治。

本研究結果顯示，47株利福平耐藥菌株中，有rpoB基因突變且出現(xiàn)突變條帶的利福平耐藥一共44株(93.62%)，提示rpoB基因突變是利福平的高發(fā)耐藥基因，與其他研究結論是一致的[11，13]。在44株rpoB特異性突變菌株中，有25株發(fā)生在WT8(密碼子S531L)上，且rpoBMUT3探針顯色，占總數(shù)的56.82%，與其他國家的研究報道一致[10,13]，說明密碼子S531L突變是利福平耐藥最常見的相關突變；8株發(fā)生在WT7條帶(密碼子H526D)上，占總數(shù)的18.18%；7株發(fā)生在WT3/4條帶(密碼子D516Y)上，占總數(shù)的15.91%；2株出現(xiàn)WT2/3條帶缺失(510～517密碼子缺失)，參照說明書判讀標準，即任何一種野生型探針缺失，菌株則判定為對利福平耐藥，且比例法藥敏試驗鑒定為利福平耐藥，與說明書一致，故判定該2株為利福平耐藥；2株出現(xiàn)WT1條帶缺失(505～509密碼子缺失)，占總數(shù)的4.55%，這種突變導致的利福平耐藥非常少見，可能與細菌基因型差異相關。rpoB基因突變且未出現(xiàn)突變條帶的利福平耐藥3株，其中1株是WT2條帶缺失(510～513密碼子缺失)、2株是單獨WT8缺失(530～533密碼子缺失)，若參照說明書判讀標準，菌株應判定為對利福平耐藥，但這3株菌株比例法藥敏試驗結果為利福平敏感，則以比例法為標準認為此3株為利福平敏感株，提示引起WT2、WT8缺失的密碼子可能與基因的沉默突變有關，即雖然發(fā)生了基因的耐藥突變，但是基因氨基酸的種類和序列并沒有改變，不會影響菌株的耐藥表型，故參考比例法藥敏試驗結果，菌株判定為對利福平敏感。

在70株異煙肼耐藥菌株中，katG高濃度耐藥突變共51株(72.86%)，雖然略低于其他國家報道的異煙肼耐藥比率[10，14]，但仍是異煙肼耐藥高發(fā)的主要因素，其中47株發(fā)生在密碼子S315T1上，占總數(shù)的92.16%。余下19株(27.14%)的異煙肼低水平耐藥是由于inhA突變引起，其中以C15T突變?yōu)橹?，這一比率高于其他報道[10-11,14]?？紤]與不同國家和地區(qū)的結核病流行情況、菌株基因型的差異導致MTB基因突變有關[15]，尤其是異煙肼低水平耐藥和高水平耐藥比率間的差異是比較大的，如不同國家和地區(qū)之間異煙肼耐藥由katG突變引起的報告比率在31.8%～96.9%之間，由inhA突變引起的在1.5%～45.9%之間[16]。

GenoType 2.0技術雖然檢測利福平和異煙肼的特異度高、檢測周期短，但作為分子生物學方法對利福平耐藥性檢測僅限于rpoB基因，異煙肼耐藥性檢測只限于katG基因和inhA基因，而對于其他耐藥基因和耐藥位點的改變引起的耐藥，或者其他耐藥機制造成的耐藥基因型與耐藥表型不一致的耐藥，本方法不能檢測到，具有一定的局限性。但作為結核病高負擔國家，GenoType 2.0 在耐藥性檢測的快速、高敏感度和高特異度方面對結核病患者的早診斷、早治療意義重大，可以在有條件的地區(qū)推廣使用。