黃 松，崔明旭*，劉愛玲，栗棲鳳，史德勝，孫月川，王一凡，劉桂蘭，李守軍

(1.瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司，天津 300300; 2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308)

麻杏石甘湯是漢代醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》中的經(jīng)典名方[1]，采用中藥材麻黃、苦杏仁、石膏和炙甘草經(jīng)水煎而成，具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效[2]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于治療風(fēng)熱感冒、急慢性支氣管炎、上呼吸道感染、支氣管哮喘等疾病，有廣闊的臨床應(yīng)用，因此，麻杏石甘湯的質(zhì)量控制尤為重要。中藥復(fù)方湯劑的成分復(fù)雜，要對其進(jìn)行質(zhì)量測定，需要多種中藥對照品，且方法復(fù)雜繁瑣，成本高昂。王智民等于2006年首次提出了一測多評法(Quantitative Analysis of Multi-components by Single-maker, QAMS)[3-8],該方法是以簡單、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的有效成分為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物與其他成分之間的相對校正因子(fk/s),最終通過fk/s計算出其他成分含量的方法。研究旨在建立一種QAMS法測定麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷3種成分含量的方法，以實(shí)現(xiàn)對麻杏石甘口服液多指標(biāo)成分的質(zhì)量評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；安捷倫1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；ME204電子天平(上海梅特勒公司)；ME55電子天平(上海梅特勒公司)；超聲波清洗器(寧波新芝公司)；0.45 μm過濾器(日本島津公司)。

1.2 材料與試劑 鹽酸麻黃堿(批號：171241-201508；含量以99.8%計)、鹽酸偽麻黃堿(批號：171237-201510；含量以99.8%計)、苦杏仁苷(批號：110820-201607；含量以90.7%計)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；麻杏石甘口服液由瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；乙腈，色譜純；甲醇，色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱(4.6 mm L.D.×250 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：207 nm；流動相：0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)H3PO4-乙腈，流動相梯度洗脫方法如表1，色譜圖如圖1。

表1 梯度洗脫方法Tab 1 Gradient elμtion methord

圖1 麻杏石甘口服液HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of the MaxingShigan Oral Medicinal Liquid

2.2 供試品溶液的制備 精確吸取麻杏石甘口服液1 mL，加入1 mL 1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液，混勻后，8000 r/min，離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm過濾器過濾后，裝入進(jìn)樣瓶，待上機(jī)。

2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 準(zhǔn)確稱量鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷適量，置于棕色容量瓶內(nèi)，用1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液溶解并定容。得到濃度分別為851.62、252.82和846.53 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0.45 μm過濾器過濾后，裝入進(jìn)樣瓶，待上機(jī)。

2.4 去麻黃陰性對照溶液的制備 按照麻杏石甘口服液的制備方法，去掉麻黃藥材，制備出去掉麻黃的麻杏石甘口服液，再按照“2.2”項下方法，制備得到去麻黃陰性對照溶液。

2.5 去苦杏仁陰性對照溶液的制備 按照麻杏石甘口服液的制備方法，去掉苦杏仁藥材，制備出去掉苦杏仁的麻杏石甘口服液，再按照“2.2”項下方法，制備得到去苦杏仁陰性對照溶液。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 將梯度稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定，分別記錄峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，特征峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，各成分標(biāo)準(zhǔn)品在上述線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 三個標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系Tab 2 Linear relationships of three standard sμbstance

2.6.2 精密度試驗 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，記錄各成分特征峰面積并計算鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷的峰面積RSD值，結(jié)果如下表3所示，鹽酸麻黃堿的峰面積RSD值為0.81%，鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD值為0.52%，苦杏仁苷的峰面積RSD值為0.68%，這一數(shù)據(jù)表示儀器精密度良好。

表3 儀器精密度測定結(jié)果Tab 3 Instrument precision test results

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，分別在0,4,8,12,16,24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄各組分色譜峰峰面積。穩(wěn)定性考察結(jié)果如下表4所示，鹽酸麻黃堿的峰面積RSD值為2.53%，鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD值為1.24%，苦杏仁苷的峰面積RSD值為1.69%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab 4 Stability test results

2.6.4 重復(fù)性試驗 按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μL，按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄各組分色譜峰峰面積。重復(fù)性考察結(jié)果如下表5所示，鹽酸麻黃堿的峰面積RSD值為1.21%，鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD值為0.74%，苦杏仁苷的峰面積RSD值為1.21%，結(jié)果表明供試品溶液在該色譜條件下重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性考察結(jié)果Tab 5 Repeated findings

2.6.5 加樣回收率試驗 取已知鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷含量的麻杏石甘口服液適量，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，記為A液。

制備含鹽酸麻黃堿1267.46 μg/mL、鹽酸偽麻黃堿948.1 μg/mL、苦杏仁苷1269.8 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL，用1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液稀釋至7.4 mL，記為B液。

分別按照A液1200、1000、800 μL和B液800、1000、1200 μL混合均勻，得到6份加樣檢測溶液。按“2.1”項下的色譜條件測定，記算各組分的平均回收率和RSD值，其檢測結(jié)果如下表6所示。根據(jù)表內(nèi)數(shù)據(jù)，本方法的加樣回收率在99%～103%范圍內(nèi)，且RSD值小于2%，表明本試驗的供試品處理方法準(zhǔn)確可行。

表6 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab 6 Results of recovery tests for variousconstituents (n=6)

2.7 相對校正因子測定

2.7.1 計算方法 取經(jīng)梯度稀釋的混合對照品溶液進(jìn)樣，按公式fk/s=fk/fs=CK×SS/CS×SK計算相對校正因子。其中：CK為內(nèi)標(biāo)物濃度；SK為內(nèi)標(biāo)物峰面積；CS為組分的濃度；SS為組分的峰面積。以鹽酸麻黃堿為內(nèi)標(biāo)物，計算鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷的相對校正因子，結(jié)果如表7所示，其相對校正因子的RSD值均小于2%，表明該方法具有較好的可行性。

表7 各組分相對校正因子Tab 7 Relative correction factors of varioμs constitμents

2.7.2 重現(xiàn)性考察 使用不同型號的高效液相色譜儀和色譜柱對相對校正因子進(jìn)行測定，計算平均值，考察其對fk/s的影響，結(jié)果如表8所示，其在不同型號的色譜儀和色譜柱下測得的相對校正因子的RSD值小于1%，表明該方法的重現(xiàn)性良好，具有較好的可行性。

表8 不同儀器和色譜柱的相對校正因子Tab 8 Relative correction factors on differentinstruments and columns

2.7.3 色譜峰定位 利用相對保留時間對待測組分進(jìn)行定位，以鹽酸麻黃堿為參照，分別考察鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷在不同高效液相色譜儀和色譜柱的相對保留時間值，試驗結(jié)果如表9所示，鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷對鹽酸麻黃堿的相對保留時間的變化較小，可以用來進(jìn)行色譜峰的定位。

表9 不同儀器和色譜柱的相對保留時間Tab 9 Relative retention time on differentinstruments and columns

2.7.4 樣品含量測定 取麻杏石甘口服液6批，分別按照“2.2”項下方法制備成供試品溶液，編號1～6，并按照“2.1”項下色譜條件分別采用外標(biāo)法和一測多評法進(jìn)行測定并計算，結(jié)果如表10所示。由表可知，兩種方法測得的麻杏石甘口服液中鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷含量的相對誤差小于0.3%，沒有顯著性差異，表明建立的一測多評方法具有較好的可行性。

表10 外標(biāo)法和一測多評法測定各組分含量結(jié)果Tab 10 Content of each component of external standard and quantitative analysis of multi-components bysingle marker(QAMS)

3 討論與結(jié)論

3.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷是麻杏石甘口服液中起作用的主要成分，均有較高的含量，由于鹽酸麻黃堿理化性質(zhì)穩(wěn)定，且2015版《中華人民共和國藥典》中的咳喘寧口服液質(zhì)量評價以鹽酸麻黃堿計，所以，選擇鹽酸麻黃堿作為內(nèi)標(biāo)物。

3.2 色譜條件的選擇 使用可見分光光度計對混合對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，綜合考慮鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷的最大光吸收，選擇207 nm為檢測波長。

供試品采用水、30%甲醇、60%甲醇和 1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液按1∶1比例混合均勻進(jìn)行提取，經(jīng)離心、過濾后進(jìn)樣，比較發(fā)現(xiàn)使用1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液進(jìn)行處理的供試品色譜圖的峰型好，分離度高。

流動相參照相關(guān)文獻(xiàn)采用乙腈-磷酸緩沖液(0.02 mol·L-1磷酸，0.05%三乙胺、3.12 g磷酸二氫鈉，pH=3)、乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等按不同體積分?jǐn)?shù)、不同比例進(jìn)行等度和梯度洗脫，其中，前兩種流動相由于所含成分多，導(dǎo)致色譜圖中存在較多溶劑峰，且梯度洗脫過程中，基線噪聲變化較大；而以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫方法得到的基線最為平穩(wěn)，各組分可以同時測定且分離度較好[9-10],故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。

3.3 結(jié)論

隨著化學(xué)藥物的藥物殘留和抗藥性問題越來越嚴(yán)重，人們對中藥的需求越來越大?，F(xiàn)有中藥的質(zhì)量評價多以單一藥材的單一成分為指標(biāo)，表征中藥的質(zhì)量[11]。但是，僅憑單一成分無法反映成分復(fù)雜的中藥制劑的優(yōu)劣，而多成分質(zhì)量控制使用傳統(tǒng)的外標(biāo)法檢測，又涉及中藥標(biāo)準(zhǔn)品緊缺和成本高昂的問題，所以，研究建立了麻杏石甘口服液的一測多評方法，利用內(nèi)標(biāo)物與待測成分間的相對校正因子，同時測定多個有效成分的含量，為麻杏石甘口服液的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供了參考[12]。本文的不足之處在于未能檢測更多來源于不同廠家的麻杏石甘口服液，對不同廠家產(chǎn)品的相對校正因子進(jìn)行考察，因此，要明確本文中一測多評法的普遍適用性，還需要對更多不同廠家和批次的麻杏石甘口服液做進(jìn)一步的研究。