李衛(wèi)鵬，姚紅艷，楊雪貞，馬衛(wèi)紅，錢 林，歐德淵,陳 希

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴陽(yáng)550025)

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒引起多種動(dòng)物感染的高度接觸性傳染病。2014年，我國(guó)首次發(fā)生H5N6亞型AIV感染人致死的案例[1]。研究表明H5N6亞型AIV可由H5N1和H6N6重組形成[2]，其中H6N6亞型AIV已經(jīng)可以在小鼠體內(nèi)進(jìn)行有效復(fù)制且引發(fā)呼吸道炎癥病變，表明其可以感染哺乳動(dòng)物[3-4]，所以對(duì)H6N6亞型AIV的防控對(duì)公共衛(wèi)生具有重要意義。近年來(lái)，中藥抗病毒的研究逐漸受到人們的重視，黃芩苷是黃芩中主要的有效成分，具有抗菌、消炎抗病毒的作用[5]。黃芩苷的體外研究表明，黃芩苷達(dá)到一定濃度時(shí)，具有抑制流感病毒增殖的作用[6]。在黃芩苷的體內(nèi)研究中，有研究表明黃芩苷可以減輕流感病毒引起的小鼠肺部損傷、延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，具有明顯的抗流感病毒作用[7]。研究擬探究不同濃度黃芩苷對(duì)感染鴨源H6N6亞型AIV的小鼠的血液指標(biāo)的影響，為黃芩苷防控低致病性禽流感提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小白鼠108只雌雄各半(6-8周齡、體重22.17±2.24g)購(gòu)于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)毒株 H6N6亞型禽流感病毒，來(lái)源于貴州省動(dòng)物疫病研究室。

1.1.3 主要試劑及儀器 黃芩苷(山西玉寧生物科技有限公司，批號(hào)：YN-20180512)，磷酸奧司他韋(宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20055532)，EDTAK2抗凝管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)，PE-6800VET三分類動(dòng)物血細(xì)胞分析儀(深圳市普康電子有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將108只6～8周齡昆明系小鼠隨機(jī)平均分為6組：陰性對(duì)照組、病毒陽(yáng)性組、西藥對(duì)照組、低劑量黃芩苷組、中劑量黃芩苷組、高劑量黃芩苷組(所有劑量均結(jié)合文獻(xiàn)依照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行體表面積換算所得)[8-10]。各組小鼠在相同條件環(huán)境下隔離飼養(yǎng)，自由采食和飲水。并于攻毒3 d后開始治療，分別于治療后3、6和9 d(各組每次采取6只小鼠)采用頸靜脈放血法處死，用EDTAK2抗凝管采集血樣。

1.2.2 攻毒與治療 攻毒：陰性對(duì)照組尾靜脈注射滅菌生理鹽水0.2 mL/只，其余各組均尾靜脈注射H6N6禽流感病毒(108EID50)0.2 mL/只。

治療：攻毒3 d后進(jìn)行灌胃給藥，低劑量黃芩苷組(0.014 mg/只/d)，中劑量黃芩苷治療組(0.028 mg/只/d)，高劑量黃芩苷治療組(0.056 mg/只/d)，西藥治療組(0.39 mg/只/d)，病毒陽(yáng)性組、陰性對(duì)照組每天給予等體積滅菌生理鹽水。

1.2.3 檢測(cè)方法 用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組攻毒效果；血液指標(biāo)用PE-6800VET三分類動(dòng)物血細(xì)胞分析儀測(cè)定108份小鼠血樣的血液指標(biāo)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)所得的結(jié)果采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀 小鼠在攻毒3 d后，出現(xiàn)呼吸急促，食欲低下，精神萎靡，被毛粗亂、無(wú)光澤等癥狀，病理解剖發(fā)現(xiàn)肺臟出血(圖1)；病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)黃芩苷治療組小鼠肺臟出血癥狀減輕(圖2-圖6)。

2.2 血清檢測(cè) 用血凝抑制試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)組小鼠的血樣進(jìn)行血凝效價(jià)檢測(cè)，攻毒后3、6和9 d血凝效價(jià)均≥24，空白對(duì)照血凝效價(jià)均<24，表明攻毒成功。

2.3 血液常規(guī)指標(biāo)變化

2.3.1 白細(xì)胞總數(shù)指標(biāo) 由表1可知，治療3、6和9 d時(shí)，病毒陽(yáng)性組白細(xì)胞總數(shù)均極顯著高于陰性對(duì)照組和西藥對(duì)照組(P<0.01)；高劑量黃芩苷組白細(xì)胞總數(shù)均極顯著低于病毒陽(yáng)性組和低、中劑量黃芩苷組(P<0.01)，顯著高于西藥對(duì)照組(P<0.05)。

表1 各組小鼠白細(xì)胞總數(shù)指標(biāo)(n=6)Tab 1 Total leukocyte number index of mice in each group (n=6)

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P<0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05).The same as below.

2.3.2 中性粒細(xì)胞指標(biāo) 由表2可知，治療3、6和9 d時(shí)，病毒陽(yáng)性組中性粒細(xì)胞數(shù)目均極顯著高于陰性對(duì)照組和所有治療組(P<0.01)；高劑量黃芩苷組中性粒細(xì)胞數(shù)目均極顯著或顯著低于低、中劑量黃芩苷組(P<0.01或P<0.05)，治療3 d時(shí)，與西藥對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；治療3和6 d時(shí)，高劑量黃芩苷治療組中性粒細(xì)胞百分比均極顯著或顯著低于低、中劑量黃芩苷組(P<0.01或P<0.05)，與西藥對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

圖1 H6N6亞型禽流感患鼠肺臟出血圖Fig 1 Pulmonary hemorrhage map of H6N6 subtype avian influenza mice

圖2 病毒陽(yáng)性組第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺臟組織切片(HE染色×400)Fig 2 Lung tissue sections of mice infected with virus-positive group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C)were stained with HE×400.

圖3 低劑量黃芩苷治療組第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺臟組織切片(HE染色×400)Fig 3 Lung tissue sections of rats in low dose baicalin treatment group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C) were stained with HE×400.

圖4 中劑量黃芩苷治療組第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺臟組織切片(HE染色×400)Fig 4 Lung tissue sections of rats in middle dose baicalin treatment group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C)were stained with HE×400.

圖6 西藥對(duì)照組第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺臟組織切片(HE染色×400)Fig 6 Lung tissue sections of rats in western medicine control group on day 3 (A),day 6 (B), day 9 (C)were stained with HE×400.

表2 各組小鼠中性粒細(xì)胞指標(biāo)(n=6)Tab 2 Neutrophil indices of mice in each group (n=6)

2.3.3 淋巴細(xì)胞指標(biāo) 由表3可知，治療3、6和9 d時(shí)，高劑量黃芩苷治療組淋巴細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞百分比均極顯著或顯著高于病毒陽(yáng)性組、低劑量黃芩苷治療組和中劑量黃芩苷治療組(P<0.01或P<0.05)，與西藥對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表3 各組小鼠淋巴細(xì)胞指標(biāo)(n=6)Tab 3 Lymphocyte indices of mice in each group (n=6)

2.3.4 紅細(xì)胞指標(biāo) 由表4可知，在治療3、6和9 d時(shí)病毒陽(yáng)性組紅細(xì)胞數(shù)目均極顯著低于所有治療組(P<0.01)，治療3和9 d時(shí)黃芩苷治療組與西藥對(duì)照組、陰性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，治療6 d時(shí)，高劑量黃芩苷組與陰性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；在治療3、6和9 d時(shí)，所有黃芩苷治療組血紅蛋白濃度和平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量均極顯著高于病毒陽(yáng)性組(P<0.01)，與陰性對(duì)照組合西藥對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表4 各組小鼠紅細(xì)胞指標(biāo)(n=6)Tab 4 Erythrocyte indices of mice in each group (n=6)

2.3.5 血小板指標(biāo) 由表5可知，在治療3、6和9 d時(shí)病毒陽(yáng)性組血小板數(shù)目均極顯著高于陰性對(duì)照組和所有治療組(P<0.01)，在治療3 d時(shí)，所有黃芩苷治療組與陰性對(duì)照組均差異不顯著(P>0.05)，在治療6和9 d時(shí)，低劑量、高劑量黃芩苷組與陰性對(duì)照組、西藥對(duì)照組均差異不顯著(P>0.05)，所有治療時(shí)段中，各組血小板壓積均差異不顯著(P>0.05)。

表5 各組小鼠血小板指標(biāo)(n=6)Tab 5 Platelet indices of mice in each group (n=6)

3 討論與結(jié)論

3.1 黃芩苷可抑制H6N6亞型AIV感染小鼠的白細(xì)胞總數(shù)升高 在禽流感引起的病毒性炎癥中，白細(xì)胞參與炎癥的不同階段。在H6N6亞型AIV入侵動(dòng)物機(jī)體時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生炎癥，其顯微變化主要表現(xiàn)為肺炎、支氣管炎等[11]。白細(xì)胞在炎癥發(fā)生時(shí)，通過滲出、趨化性和吞噬作用等方式對(duì)機(jī)體進(jìn)行保護(hù)。在趙維波[12]等人研究中，靜脈注射禽流感病毒3 d后，小鼠白細(xì)胞總數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)目均顯著高于正常值。本試驗(yàn)小鼠感染H6N6亞型AIV后，治療第3、6和9 d時(shí)病毒陽(yáng)性組白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)目均極顯著高于陰性對(duì)照組的結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，根據(jù)血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果和血液指標(biāo)檢測(cè)，表明造模成功。

在中藥抗病毒的過程中，有直接作用和間接作用[13]。孫鸝[14]等研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞需要細(xì)胞黏附因子的參與，才能夠通過微血管壁進(jìn)入炎區(qū)。解曉霞[15]等的研究表明，黃芩苷能夠抑制CD54、CD106、TNF-α、可溶性CD54的表達(dá)，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)，降低炎性反應(yīng)。黃芩苷可以通過抑制黏附因子的表達(dá)，從而降低白細(xì)胞滲出的數(shù)量，減少白細(xì)胞的聚集，從而可以減少白細(xì)胞所釋放的酶類、炎癥介質(zhì)等引起或者加劇組織損傷。萬(wàn)巧鳳[16]等的研究結(jié)果表明，黃芩苷可以通過抑制流感病毒感染的轉(zhuǎn)錄因子AP-1的高表達(dá)，從而降低炎性細(xì)胞的分泌，從而緩解炎癥的病理?yè)p傷。本試驗(yàn)中黃芩苷治療可有效抑制可抑制H6N6亞型AIV感染小鼠的白細(xì)胞總數(shù)升高，推測(cè)可能是黃芩苷通過抑制炎性因子的產(chǎn)生從而使減少白細(xì)胞的產(chǎn)生。

3.2 黃芩苷可降低禽流感患鼠的中性粒細(xì)胞數(shù)目

中性粒細(xì)胞在機(jī)體防御和抵抗病原侵襲過程中起著非常重要的作用，常見于急性炎癥初期[17]。在禽流感病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的過程中，HA2亞基起到介導(dǎo)病毒遺傳物質(zhì)釋放到細(xì)胞中的作用[18]。中性粒細(xì)胞需要通過趨化、黏附和吞噬等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的保護(hù)，此時(shí)不僅大量出現(xiàn)在炎區(qū)，外周循環(huán)血液中的數(shù)量也會(huì)增多[19]。

在本試驗(yàn)中，黃芩苷治療組中性粒細(xì)胞數(shù)目均極顯著低于病毒陽(yáng)性組。楊潔[20]等人研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以通過抑制血凝素HA2亞基的活性，降低病毒遺傳在細(xì)胞中的復(fù)制，從而抑制流感細(xì)胞對(duì)機(jī)體的侵入，這可能也是中性粒細(xì)胞數(shù)目降低的原因。

3.3 黃芩苷可升高禽流感患鼠的淋巴細(xì)胞數(shù)目 淋巴細(xì)胞常見于慢性炎癥、炎癥恢復(fù)期、病毒性炎癥過程中，具有與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的能力，其中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群在動(dòng)物外周血中的分布量以及CD4+/CD8+的比值是重要的免疫狀態(tài)檢測(cè)指標(biāo)[21]。譽(yù)鐵歐[22]等通過對(duì)人感染H7N9禽流感流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒攻擊機(jī)體后淋巴細(xì)胞數(shù)目降低，T淋巴亞群降低等免疫失衡的現(xiàn)象。本試驗(yàn)治療3、6和9 d時(shí)，病毒陽(yáng)性組淋巴細(xì)胞數(shù)目均極顯著低于陰性對(duì)照組這一結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。薛洋[23]等研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以使傳染性支氣管炎患雞雞外周血內(nèi)CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞顯著增加，這與本試驗(yàn)黃芩苷治療組淋巴細(xì)胞均極顯著高于病毒陽(yáng)性組的結(jié)果一致。

3.4 黃芩苷可以減少炎癥中出血反應(yīng) 在流感病毒侵襲動(dòng)物機(jī)體的過程中，紅細(xì)胞和血紅蛋白的減少，常見于機(jī)體失血性貧血[24]，血小板數(shù)目的升高，預(yù)示著有炎癥損傷或內(nèi)臟器官出血或淤血[25]。在止血的過程中，血小板與纖維蛋白原的關(guān)系既是促進(jìn)，又是抑制。在凝血環(huán)節(jié)PF2促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白單體，加速凝血，減少紅細(xì)胞從血管滲出，到了血栓后期，隨著血小板解體和釋放反應(yīng)增加，釋放纖溶酶原激活物，直接參與纖維蛋白溶解[26]。黃芩苷有強(qiáng)的抑制血小板聚集的作用，并能抑制纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，因而有抗凝血作用，通過減少血小板的聚集從而減輕炎癥中組織器官淤血情況。本試驗(yàn)中治療6d和9d時(shí)，中、高劑量黃芩苷組紅細(xì)胞數(shù)目較病毒陽(yáng)性組均極顯著上升，所有治療時(shí)段黃芩苷治療組較病毒陽(yáng)性組血小板總數(shù)均顯著降低這一結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。

3.5 結(jié)論 試驗(yàn)通過檢測(cè)不同濃度黃芩苷治療感染H6N6亞型禽流感病毒患鼠的血常規(guī)指標(biāo)，與陰性對(duì)照組、病毒對(duì)照組、西藥治療組的血液指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，表明黃芩苷在較高濃度時(shí)對(duì)H6N6禽流感引起的炎癥反應(yīng)中，具有降低白細(xì)胞總數(shù)，抑制出血反應(yīng)的作用。但由于黃芩苷水溶性差的特點(diǎn)，對(duì)于黃芩苷抗病毒的最適濃度，還需有待進(jìn)一步的研究，以便對(duì)其更好的開發(fā)與利用。