卓國榮，聶 巧，王東亮，陳鴻雨，秦 琪，卜仕金,3*，張明珠，楊海峰，孫晨明

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300; 3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

磺胺氯吡嗪鈉(SPZ)屬于磺胺類抗菌藥，常用于雞球蟲病的治療[1-2]，也用于球蟲病爆發(fā)時繼發(fā)的細(xì)菌病(禽傷寒、禽霍亂)防治[3]；甲氧芐啶(TMP)是目前國內(nèi)常用的磺胺抗菌增效劑，屬于二氨基嘧啶類化學(xué)合成抗菌藥，與磺胺類藥物合用可使磺胺類藥物抗菌抗菌活性大大增強(qiáng)[4]，從而可以解決目前臨床中磺胺氯吡嗪鈉單方應(yīng)用時逐漸增加的耐藥性問題。本試驗(yàn)建立雞血漿中磺胺氯吡嗪-甲氧芐啶含量測定的HPLC法，對開展磺胺氯吡嗪鈉-甲氧芐啶可溶性粉在雞體內(nèi)的藥動學(xué)和生物利用度研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 對照品 磺胺氯吡嗪鈉(分子式C10H8N4O2ClNaS·H2O)對照品：含量為99.0%(以磺胺氯吡嗪鈉計(jì))，0.1 g/棕色絲口玻璃瓶，批號40908，購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。使用前無需干燥處理。甲氧芐啶(分子式C14H18N4O3)對照品：含量為99.9%(以甲氧芐啶計(jì))，100 mg/安剖瓶，批號100031-201405，購自中國食品藥品檢定研究院。使用前無需干燥處理。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純，購自美國TEDIA公司。磷酸二氫鉀為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試液的配制

1.3.1 0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液 準(zhǔn)確稱取2.7218 g磷酸二氫鉀，用1000 mL超純水定容并混勻，即制得0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液。

1.3.2 20%甲醇溶液 將甲醇和超純水按20∶80(V/V)比例混勻，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，超聲脫氣20 min即可?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 磺胺氯吡嗪儲備液 精密稱取磺胺氯吡嗪鈉對照品約28.9 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即配成濃度為1000 μg/mL的磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液。置-20 ℃冷凍保存。

1.3.4 甲氧芐啶儲備液 精密稱取甲氧芐啶對照品約25.0 mg于25 mL量瓶中，用乙腈溶解定容并超聲助溶，即配成濃度為1000 μg/mL的甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)儲備液。置-20 ℃冷凍保存。

1.3.5 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 分別準(zhǔn)確吸取適量磺胺氯吡嗪儲備液和甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用20%甲醇溶液稀釋使磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的濃度分別為1、5、20、50、100、200、700 μg/mL和0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 血漿樣品制備 試驗(yàn)采用黃羽肉雞，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，出殼后飼養(yǎng)在嚴(yán)格消毒的雞籠內(nèi)，至35日齡時從翅下靜脈采血，血樣置于肝素浸潤并烘干的離心管內(nèi)，3500 r/min，離心10 min，-20 ℃冷凍備用。

1.5 儀器及設(shè)備 高效液相色譜儀，Agilent 1260型高效液相色譜儀，配有紫外檢測器和色譜工作站，Agilent公司；色譜柱，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm，5 μm)，Agilent公司；UPH-11-20T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司；N-EVAPTM112型干浴氮吹儀，美國Organomation公司；電子分析水平，感量0.0001 g，德國塞多利斯天平公司；PB-10型PH計(jì)，德國塞多利斯天平公司；KS-250D超聲儀，寧波科生儀器廠；WH-1微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；5810-R型高速冷凍離心機(jī)，德國eppendorf股份公司；可調(diào)微量移液器，10～100、20～200、100～1000 μL，德國eppendorf股份公司；10 mL指形管，揚(yáng)子化工玻璃儀器有限公司；1.5 mL指形管，美國Axygen公司。

2 方法

2.1 血漿樣品前處理 準(zhǔn)確吸取室溫下解凍后的血漿樣品200 μL置于1.5 mL指形管中，加入1 mL乙腈渦旋振蕩3 min后，離心10 min(4 ℃，14000 r/min)，將上清液移至10 mL指形管中。殘?jiān)? mL乙腈渦旋振蕩3 min，離心10 min(4 ℃，14000 r/min)，合并上清液。取上清液于40 ℃干浴氮?dú)獯蹈珊螅尤?0%甲醇溶液200 μL溶解，渦旋振蕩3 min。將復(fù)溶后的溶液移至1.5 mL指形管內(nèi)，離心10 min(4 ℃，14000 r/min)，取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液供HPLC分析。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm，5 μm)；流動相： A相，甲醇；B相，0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(表1)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL； 紫外檢測波長：0 ～ 13.5 min，λ1=240 nm(甲氧芐啶)；13.5 ～ 21 min，λ2=268 nm(磺胺氯吡嗪)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 分別準(zhǔn)確吸取180 μL室溫解凍的空白血漿于7支1.5 mL指形管中，并依次分別加入對應(yīng)濃度的磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL，渦旋30 s混勻，使磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的濃度分別為0.1、0.5、2、5、10、20、70 μg/mL和0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL。即制得以上系列磺胺氯吡嗪、甲氧芐啶空白血漿添加濃度。將上述樣品按照2.1項(xiàng)下的血漿樣品處理方法處理后，進(jìn)行HPLC分析。外標(biāo)法定量，以磺胺氯吡嗪(As)和甲氧芐啶(As)對各自的血藥濃度(C)分別進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。共作3次平行試驗(yàn)。

表1 流動相梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions of mobile phase

2.4 定量限(LOQ)和檢測限(LOD) 分別將含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.5、1.0、5.0 μg/mL和0.25、0.50、1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL加入180 μL空白血漿中，渦旋混勻后制得血漿樣品中分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的濃度為0.05、0.10、0.50 μg/mL和0.025、0.050、0.100 μg/mL，每個濃度制備5個平行樣品。依據(jù)2.1項(xiàng)下的血漿樣品處理方法處理，上清液供HPLC分析，測得各樣品的峰高與噪音(基線峰高)。取信噪比S/N≥3時濃度為檢測限(LOD)；取信噪比S/N≥10，且結(jié)合精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果確定定量限(LOQ)。

2.5 回收率 取1.5 mL指形管數(shù)支，按照2.3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、70.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個濃度制備5個平行樣品。按2.1項(xiàng)下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后，取上清液20 μL作HPLC分析。分別將測得磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的峰面積(As)，代入當(dāng)天的各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測濃度。實(shí)測濃度與添加濃度之比值乘以百分?jǐn)?shù)即為相對回收率。

2.6 精密度 取1.5 mL指形管數(shù)支，按照2.3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、70.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品及一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，每批每個濃度制備5份平行樣品，連續(xù)3 d，共作三個批次。按2.1項(xiàng)下血漿樣品處理方法操作。分別將測得磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的峰面積(As)，代入當(dāng)天的各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到實(shí)測濃度，據(jù)此分別計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

2.7 穩(wěn)定性

2.7.1 儲備液的穩(wěn)定性 按1.3.5項(xiàng)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制備方法，制備含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL的三個濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個濃度制備5個平行。制備后立刻對樣品進(jìn)行分析，得到第0時數(shù)據(jù)。之后將兩種儲備液分別于凍存(約-20 ℃)30、60、90 d后按上述方法配制并進(jìn)行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較考察儲備液貯存期間的穩(wěn)定性。

2.7.2 樣品室溫放置下的穩(wěn)定性 按照2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品，每個濃度制備5個平行樣品。按2.1項(xiàng)下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后，立刻取上清液20 μL作HPLC分析，得到第0時數(shù)據(jù)；之后在室溫(約22 ℃)下分別放置2、6、8 h后進(jìn)行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較，考察樣品室溫放置時磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的穩(wěn)定性。

2.7.3 樣品反復(fù)凍融下的穩(wěn)定性 按照2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品，每個濃度制備5個平行樣品。按2.1項(xiàng)下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后，立刻取上清液20 μL作HPLC分析，得到第0時數(shù)據(jù)；在-20 ℃下至少儲存一天后取出解凍，之后再次冷凍、解凍，反復(fù)共進(jìn)行3次凍融循環(huán)處理。兩次凍融間隔時間至少為5 h。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較，考察反復(fù)凍融下樣品中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的穩(wěn)定性。

2.7.4 樣品凍存期間的穩(wěn)定性 按照2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品，每個濃度制備5個平行樣品。按2.1項(xiàng)下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后，立刻取上清液20 μL作HPLC分析，得到第0時數(shù)據(jù)；之后分別于凍存(約-20 ℃)10、20、40 d后進(jìn)行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較，考察樣品貯存期間的穩(wěn)定性。

2.8 干擾性

2.8.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的干擾性 按1.3.5項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制備方法，制備2 mL含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL的三個濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；準(zhǔn)確吸取適量磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用20%甲醇溶液稀釋使磺胺氯吡嗪的濃度分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL；準(zhǔn)確吸取適量甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用20%甲醇溶液稀釋使甲氧芐啶的濃度分別為0.05、0.50、5.00 μg/mL。每個濃度制備5個平行。

上述標(biāo)準(zhǔn)工作液制備后取20 μL于2.2項(xiàng)下色譜條件下作HPLC分析。通過相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品與單一磺胺氯吡嗪或甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品測定的數(shù)據(jù)比較，考察混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中同時存在磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶時，對彼此測定結(jié)果的干擾性影響。

2.8.2 空白血漿添加樣品的干擾性 按照2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加磺胺氯吡嗪-甲氧芐啶樣品；取20 μL經(jīng)20%甲醇溶液稀釋至1、2、20 μg/mL濃度的磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加至180 μL空白血漿中，制備0.1、2.0、20.0 μg/mL三個濃度的空白血漿添加磺胺氯吡嗪樣品；取20 μL經(jīng)20%甲醇溶液稀釋至0.5、5.0、50.0 μg/mL濃度的甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加至180 μL空白血漿中，制備0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加甲氧芐啶樣品。每個濃度制備5個平行樣品。

將上述樣品按2.1項(xiàng)下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后，取上清液20 μL于2.2項(xiàng)下色譜條件下作HPLC分析。通過血漿添加相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品與單一磺胺氯吡嗪或甲氧芐啶測定的數(shù)據(jù)比較，考察樣品中同時存在磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶時對彼此測定結(jié)果的干擾性影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶血漿樣品測定的色譜圖 磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品和甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)品、空白血漿及空白血漿添加甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜分析圖分別見圖1～圖5。在本試驗(yàn)建立的色譜條件下，磺胺氯吡嗪出峰時間在14.9 min左右，甲氧芐啶出峰時間在9.1 min左右，且待測組分與溶劑峰及血漿中其他基質(zhì)組分能完全分開。

圖1 磺胺氯吡嗪(0.05 μg/mL)和甲氧芐啶(0.025 μg/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig 1 Chromatogram of Standard Mixtures of SPZ (0.05 μg/mL) and TMP (0.025 μg/mL)

圖2 空白血漿色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank plasma

圖3 空白血漿添加磺胺氯吡嗪(0.05 μg/mL)和甲氧芐啶(0.025 μg/mL)樣品色譜圖Fig 3 Chromatogram of blank plasma added with SPZ (0.05 μg/mL) and TMP (0.025 μg/mL)

圖4 磺胺氯吡嗪(0.1 μg/mL)和甲氧芐啶(0.05 μg/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig 4 Chromatogram of Standard Mixtures of SPZ(0.1 μg/mL)and TMP (0.05 μg/mL)

圖5 空白血漿添加磺胺氯吡嗪(0.1 μg/mL)和甲氧芐啶(0.05 μg/mL)樣品色譜圖Fig 5 Chromatogram of blank Plasma added with SPZ(0.1 μg/mL) and TMP (0.05 μg/mL)

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

3.2.1 磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 磺胺氯吡嗪的血漿藥物濃度在0.1～70.00 μg/mL范圍內(nèi)，血漿藥物濃度與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系(R2=1.0000)。結(jié)果見表2。以血藥濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

表2 磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab 2 Linear regression equation and correlationcoefficient of SPZ

圖6 磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 6 Standard working curve of SPZ

3.2.2 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 甲氧芐啶的血漿藥物濃度在0.05～5.00 μg/mL范圍內(nèi)，血漿藥物濃度與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)。結(jié)果見表3。以血藥濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。

表3 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab 3 Linear regression equation and correlationcoefficient of TMP

圖7 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 7 Standard working curve of TMP

3.3 檢測限和定量限 取信噪比S/N≥3時的濃度為最低檢測限，信噪比S/N≥10時的濃度為定量限。根據(jù)檢測得，該方法磺胺氯吡嗪的檢測限為0.05 μg/mL，定量限為0.1 μg/mL；甲氧芐啶的檢測限為0.025 μg/mL，定量限為0.05 μg/mL。

3.4 回收率 在空白血漿添加樣品中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的回收率測定結(jié)果分別見表4和表5。由表4可見，磺胺氯吡嗪空白血漿添加水平在0.1～70.0 μg/mL時，回收率在92%～104%之間；由表5可見，甲氧芐啶空白血漿添加水平在0.05～5.00 μg/mL時，回收率在91%～96%之間。

表4 空白血漿添加磺胺氯吡嗪樣品相對回收率(%)(n=5)Tab 4 Relative recoveries of SPZ in blank plasma (%) (n = 5)

表5 空白血漿添加甲氧芐啶樣品相對回收率(%)(n=5)Tab 5 Relative recoveries of TMP in blank plasma (%) (n = 5)

3.5 精密度 在空白血漿添加樣品中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的批內(nèi)和批間精密度測定結(jié)果分別見表6和表7。由表6可見，磺胺氯吡嗪空白血漿添加水平在0.1～70.0 μg/mL時，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于6.61%和5.18%；由表7可見，甲氧芐啶空白血漿添加水平在0.05～5.00 μg/mL時，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于6.89%和6.84%。

3.6 穩(wěn)定性

3.6.1 儲備液存儲期間的穩(wěn)定性 磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶儲備液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分別見表8和表9。結(jié)果表明，磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶儲備液于-20 ℃條件下凍存能夠保持穩(wěn)定達(dá)90 d。

表6 空白血漿添加磺胺氯吡嗪精密度測定結(jié)果Tab 6 Precision determination of SPZ in blank plasma

n.樣本數(shù);RSD. 變異系數(shù).

表7 空白血漿添加甲氧芐啶精密度測定結(jié)果Tab 7 Precision determination of TMP in blank plasma

表8 磺胺氯吡嗪儲備液在-20 ℃貯存條件下的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 8 The stability of SPZ stock solutions stored at -20℃(n=20)

表9 甲氧芐啶儲備液在-20 ℃貯存條件下的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 9 The stability of TMP stock solutions stored at -20℃(n=20)

3.6.2 室溫放置下的穩(wěn)定性 室溫放置下樣品的穩(wěn)定性測定結(jié)果分別見表10和表11。結(jié)果表明，雞血漿樣品在室溫條件(約22 ℃)下放置時磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶均可保持穩(wěn)定達(dá)8 h。

表10 空白血漿添加樣品放置室溫(+22 ℃)下磺胺氯吡嗪的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 10 The stability of SPZ in blank plasma at room temperature (+22℃) (n=20)

表11 空白血漿添加樣品放置室溫(+22 ℃)下甲氧芐啶的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 11 The stability of TMP in blank plasma at room temperature (+22℃) (n=20)

3.6.3 反復(fù)凍融下的穩(wěn)定性 血漿樣品反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性測定結(jié)果見表12和表13。結(jié)果表明，雞血漿樣品經(jīng)三個循環(huán)凍融后其磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶仍能保持較好的穩(wěn)定性。

表12 空白血漿添加樣品經(jīng)三個凍融循環(huán)(+22 ℃/-20 ℃)后磺胺氯吡嗪的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 12 The stability of SPZ in blank plasma after three freeze-thaw cycles(+22 ℃/-20 ℃)(n=20)

表13 空白血漿添加樣品經(jīng)三個凍融循環(huán)(+22 ℃/-20 ℃)后甲氧芐啶的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 13 The stability of TMP in blank plasma after three freeze-thaw cycles (+22 ℃/-20 ℃)(n=20)

3.6.4 樣品存儲期間的穩(wěn)定性 樣品存儲期間穩(wěn)定性測定結(jié)果見表14和表15。結(jié)果表明，血漿樣品于-20 ℃條件下凍存時磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶能夠保持穩(wěn)定達(dá)40 d。

表14 空白血漿添加樣品在-20 ℃凍存條件下磺胺氯吡嗪的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 14 The stability of SPZ in blank plasma after storing at -20 ℃(n=20)

表15 空白血漿添加樣品在-20 ℃凍存條件下甲氧芐啶的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 15 The stability of TMP in blank plasma after storing at -20℃(n=20)

3.7 干擾性

3.7.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的干擾性 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的干擾性試驗(yàn)測定結(jié)果見表16。結(jié)果表明，磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶在2.2項(xiàng)的色譜條件下測定兩者之間不會產(chǎn)生相互干擾。

表16 磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液與甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)工作液之間的干擾性試驗(yàn)測定結(jié)果(n=10)Tab 16 Interference test results between standard working fluid of SPZ and standard working fluid of TMP(n=10)

3.7.2 空白血漿添加樣品的干擾性 空白血漿添加磺胺氯吡嗪與甲氧芐啶樣品，兩者之間的干擾性試驗(yàn)測定結(jié)果見表17。結(jié)果表明，兩者之間的出峰時間及實(shí)測濃度均不會產(chǎn)生相互干擾現(xiàn)象。

表17 空白血漿添加磺胺氯吡嗪與甲氧芐啶樣品的出峰時間干擾性試驗(yàn)測定結(jié)果(n=10)Tab 17 The results of interferential test of peak time of SPZ and TMP in blank plasma (n=10)

4 討 論

4.1 確定磺胺氯吡嗪的紫外檢測波長 分別將0.5、1、2 μg/mL的磺胺氯吡嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL加入180 μL空白血漿中，渦旋混勻后分別制得0.05、0.1、0.2 μg/mL三個磺胺氯吡嗪空白添加血漿濃度。依據(jù)2.1項(xiàng)下的血漿樣品處理方法處理后，設(shè)置DAD為200～400 nm全波長掃描(步進(jìn)值為2 nm)，按2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC光譜分析。每個濃度重復(fù)3次，確定磺胺氯吡嗪最大紫外吸收波長和最佳檢測波長。

在2.2項(xiàng)建立的色譜條件下，磺胺氯吡嗪最大紫外吸收波長為268 nm，且僅在此檢測波長下磺胺氯吡嗪檢測限能夠達(dá)到0.05 μg/mL，故本試驗(yàn)采用268 nm為磺胺氯吡嗪的紫外檢測波長。

4.2 確定甲氧芐啶的紫外檢測波長 分別將0.25、0.5、1 μg/mL的甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL加入180 μL空白血漿中，渦旋混勻后分別制得0.025、0.05、0.1 μg/mL三個甲氧芐啶空白添加血漿濃度。依據(jù)2.1項(xiàng)下的血漿樣品處理方法處理后，設(shè)置DAD為200～400 nm全波長掃描(步進(jìn)值為2 nm)，按2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC光譜分析。每個濃度重復(fù)3次，確定甲氧芐啶最大紫外吸收波長和最佳檢測波長。在2.2項(xiàng)建立的色譜條件下，甲氧芐啶最大紫外吸收波長為200 nm，但在該條件下經(jīng)過檢測器的其他物質(zhì)也有很大吸收，綜合考慮選擇240 nm作為甲氧芐啶的檢測波長，且在此檢測波長下甲氧芐啶檢測限能夠達(dá)到0.025 μg/mL，故本試驗(yàn)采用240 nm為甲氧芐啶的紫外檢測波長。

4.3 血漿中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的提取方法 研究表明在對血樣進(jìn)行處理時主要使用乙腈[5-7]、乙酸乙酯[8]、無水乙醇[9]、10%高氯酸[10]。在血漿中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的提取方法研究中，試驗(yàn)先后用1 mL純甲醇、1 mL乙腈、1mL乙腈-異丙醇(4 ∶1)、1mL乙腈-甲醇(4 ∶1)4種方法萃取藥物，發(fā)現(xiàn)甲醇提取時雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，其余三種方法兩種藥物回收率均在80%以上，純乙腈提取較其他組回收率高且雜質(zhì)較少。又繼續(xù)比較了以1 mL乙腈提取一次和提取兩次，發(fā)現(xiàn)兩次提取時兩種藥物的回收率均較一次提取回收率高且均無雜質(zhì)干擾藥峰，故選擇提取方法為用1 mL乙腈提取兩次。

4.4 血漿中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶含量的測定方法 在本試驗(yàn)建立的測定磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶色譜條件下，以安捷倫1260進(jìn)行DAD全波長掃描，發(fā)現(xiàn)磺胺氯吡嗪在268 nm紫外檢測波長處有最大吸收，甲氧芐啶最大紫外吸收波長為200 nm，但在該條件下經(jīng)過檢測器的其他物質(zhì)也有很大吸收，綜合考慮選擇240 nm作為甲氧芐啶的檢測波長。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為室溫或30 ℃時，雜峰干擾甲氧芐啶藥物峰，當(dāng)溫度為35 ℃時，甲氧芐啶藥峰與雜峰完全分離。研究表明流動相用甲醇和水時，藥物保留時間不穩(wěn)定，當(dāng)流動相中加入磷酸二氫鉀時藥物保留時間穩(wěn)定，將有機(jī)相換成乙腈時基線向下漂移。多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用流動相溶解氮吹后的殘?jiān)鼤?dǎo)致磺胺氯吡嗪析出，而更換純甲醇會導(dǎo)致磺胺氯吡嗪出現(xiàn)前沿峰、甲氧芐啶裂峰，將其更換為甲醇和水的混合溶液時藥物峰面積和保留時間穩(wěn)定。比較甲醇和水體積比分別為80∶20、70∶30、50∶50、30∶70、20∶80對藥物檢測靈敏度的影響，研究表明甲醇和水的體積比為20∶80時對兩種藥物的檢測靈明度均最高，因此,選用甲醇水(20∶80，V/V)溶解氮吹后的殘?jiān)⒖紝O晨明[5]的研究，本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫有效改善峰形且縮短兩藥物出峰時間差，同時采用雙波長檢測降低甲氧芐啶的檢測限和定量限，提高靈敏度。當(dāng)前色譜條件下，磺胺氯吡嗪出峰時間為14.9 min左右，甲氧芐啶出峰時間為9.1 min左右，待測藥物磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶均能夠在圖譜上呈現(xiàn)較好的峰形，與其他雜質(zhì)峰分離開，并且能夠準(zhǔn)確定量。

5 結(jié) 論

在本試驗(yàn)所建立的HPLC條件下，空白血漿添加磺胺氯吡嗪、甲氧芐啶分別在0.1～70.0 μg/mL和0.05～5.00 μg/mL范圍內(nèi)，藥物濃度與檢測器響應(yīng)值之間相關(guān)性良好(R2= 0.9999)；回收率分別在92% ～ 103%和91% ～ 96%之間；批內(nèi)系數(shù)分別小于6.62%和5.18%，批間系數(shù)分別小于6.89%和6.84%。該方法磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的檢測限分別為0.05 μg/mL和0.025 μg/mL，定量限分別為0.1 μg/mL和0.05 μg/mL。

本試驗(yàn)所建立的反相高效液相色譜-紫外檢測法，分析成本低，操作便捷，檢測迅速，方法的靈敏度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性均能滿足磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的單獨(dú)或同時血藥濃度檢測需求，能夠?yàn)檫M(jìn)一步的磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶藥動學(xué)研究和生物利用度研究提供依據(jù)，從而對臨床合理用藥和抗球蟲藥物新制劑的研發(fā)提供指導(dǎo)。