李水根，李秀芬，李記開(kāi)，朱建軍

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所，上海201403）

紅掌（Anthurium andraeanum）為天南星科（Araceae）花燭屬（Anthurium Schott）多年生草本花卉，原產(chǎn)于南美洲的熱帶雨林。紅掌佛焰苞顏色鮮艷，花型優(yōu)美，具有較高的觀賞價(jià)值，通常用于鮮切花、盤花和花壇造景［1］。組織培養(yǎng)方法是紅掌種苗進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)的主要途徑，其中愈傷發(fā)生的間接不定芽再生途徑是目前最為高效穩(wěn)定的紅掌組培快繁技術(shù)手段，同時(shí)也是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體系統(tǒng)［2］。然而紅掌胚性愈傷的發(fā)生能力受到基因型的影響，且再生周期較長(zhǎng)，嚴(yán)重影響紅掌分子育種的進(jìn)程。胚性愈傷的生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響不定芽的分化能力，提高紅掌胚性愈傷的發(fā)生頻率和質(zhì)量，可以降低紅掌組培快繁的生產(chǎn)成本，對(duì)于紅掌的種苗生產(chǎn)具有重要意義。

紅掌胚性愈傷的發(fā)生受到外植體、培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等因素的影響。Perik［3］最早開(kāi)展紅掌的組織培養(yǎng)研究，采用葉片進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得了胚性愈傷，并最終成功誘導(dǎo)植株再生。此后，研究人員開(kāi)展了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)紅掌的葉片、葉柄、佛焰苞、合子胚和花粉均可以作為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷的發(fā)生［4-5］。誘導(dǎo)愈傷發(fā)生的植物激素一般采用細(xì)胞分裂素 6-BA［6-9］，配合使用生長(zhǎng)素 2，4-D［6-7，9］或NAA［8，10］。單獨(dú)使用6-BA或 TDZ［11-12］也能誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生。誘導(dǎo)的愈傷組織類型多樣［13］，有致密顆粒狀和松散易碎狀，它們具有不同的分化潛能。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素6-BA可以有效誘導(dǎo)紅掌愈傷分化形成不定芽［6］。不定芽的發(fā)生起源于愈傷組織的表面，將愈傷進(jìn)行表面劃痕和再次切割后，能有效提高不定芽的分化頻率［13］。紅掌在叢生芽增殖時(shí)期就有不定根同步發(fā)生，而且較容易形成氣生根。雖然紅掌生根較容易［5］，但不定根的數(shù)量較少，不定根的數(shù)量和質(zhì)量直接影響植株后期移栽的成活率。

一氧化氮（NO）作為一種氣體分子，在植物體內(nèi)廣泛存在。Shen等［14］研究發(fā)現(xiàn)，NO調(diào)控植物愈傷的發(fā)生和不定芽再生。硝普鈉（SNP）作為NO的供體化學(xué)物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于植物研究中。SNP處理可以提高山藥愈傷組織發(fā)生和植株再生的頻率［15］，促進(jìn)櫻桃砧木不定芽的增殖和生根［16］。本試驗(yàn)開(kāi)展SNP處理對(duì)紅掌愈傷誘導(dǎo)、不定芽再生和植株生根的研究，以期提高紅掌的植株再生頻率和組培苗質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以紅掌‘阿拉巴馬’的幼嫩葉片為外植體，通過(guò)愈傷誘導(dǎo)的間接器官發(fā)生途徑，建立紅掌不定芽再生體系。將紅掌植株剪成帶有單個(gè)芽的莖段，轉(zhuǎn)接到新的增殖培養(yǎng)基上，每個(gè)月繼代一次，實(shí)現(xiàn)不定芽的繼代培養(yǎng)。

為了誘導(dǎo)胚性愈傷組織發(fā)生，以上述繼代培養(yǎng)的植株葉片為外植體，將葉片橫向剪成兩半，葉背面朝下接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。約2個(gè)月后愈傷從葉片傷口處發(fā)生，將愈傷轉(zhuǎn)接于不定芽分化培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月左右，不定芽從胚性愈傷上誘導(dǎo)發(fā)生。將大于1 cm的不定芽從愈傷組織上切下，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上，約1個(gè)月后植株基部可誘導(dǎo)不定根發(fā)生。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

紅掌不定芽增殖培養(yǎng)基以Pierik medium［3］為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加0.5 mg/L 6-糠基氨基嘌呤（KT）和0.05 mg/L萘乙酸（NAA），培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000—3 000 lx，光照周期為16 h光照∶8 h黑暗。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以Pierik medium為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加0.5 mg/L噻苯隆（TDZ）、30 g/L蔗糖、2.8 g/L結(jié)冷膠，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，暗培養(yǎng)。不定芽分化培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）、25 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂粉。生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加0.2 mg/L吲哚丁酸（IBA）、0.4 g/L活性炭、25 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂粉。不定芽分化培養(yǎng)和植株生根培養(yǎng)的溫度均為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000—3 000 lx，光照周期為16 h光照∶8 h黑暗。

在紅掌愈傷誘導(dǎo)、不定芽分化和植株生根的過(guò)程中添加不同濃度的SNP。將SNP粉末配制成母液濃度為0.2 mol/L的水溶液，過(guò)濾滅菌后分裝于棕色離心管中，保存于-20℃?zhèn)溆?。愈傷誘導(dǎo)、不定芽分化以及植株生根的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件與上述相同。將培養(yǎng)基高溫高壓（121℃，103—107 kPa）滅菌20 min后，冷卻至60℃，添加SNP母液，使愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽分化培養(yǎng)基和植株生根培養(yǎng)基中所含SNP的濃度梯度分別為0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L。將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理10皿，每皿接種12個(gè)外植體。將不定芽分化培養(yǎng)基分裝于罐頭瓶中，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種5塊愈傷組織。將植株生根培養(yǎng)基分裝于罐頭瓶中，每個(gè)處理接種6瓶，每瓶接種5棵植株。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將葉片外植體轉(zhuǎn)接到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的愈傷發(fā)生率和愈傷鮮重。愈傷發(fā)生率＝（發(fā)生愈傷的外植體數(shù)量/接種的外植體數(shù)量）×100%。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)每瓶中不定芽誘導(dǎo)率以及每塊愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的數(shù)量。不定芽誘導(dǎo)率＝（發(fā)生不定芽的愈傷數(shù)量/接種的愈傷數(shù)量）×100%。將不定芽剪下后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)每棵植株不定根的數(shù)量和長(zhǎng)度。采用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差分析采用Duncan多重比較，P≤0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度SNP處理對(duì)紅掌葉片愈傷誘導(dǎo)的影響

以繼代培養(yǎng)的紅掌植株葉片為外植體，將葉片從中間剪成兩半，接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基約2個(gè)月后，白色致密型愈傷組織從葉片傷口處發(fā)生，同時(shí)在葉柄傷口處也有部分愈傷組織發(fā)生（圖1）。在添加不同濃度的SNP培養(yǎng)基上，愈傷的發(fā)生具有一定程度的差異。其中，在添加20μmol/L SNP的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，葉片愈傷的誘導(dǎo)率和鮮重均最高，顯著高于對(duì)照。當(dāng)SNP濃度為40μmol/L時(shí)，愈傷的誘導(dǎo)率和鮮重比對(duì)照顯著增加，但是外植體傷口處出現(xiàn)黃化，最后部分葉片發(fā)生褐化凋亡。當(dāng)SNP濃度為80μmol/L時(shí)，愈傷的誘導(dǎo)率和鮮重均受到了嚴(yán)重的抑制（表1），外植體的黃化現(xiàn)象更為明顯。試驗(yàn)表明，適宜濃度的SNP可促進(jìn)紅掌葉片胚性愈傷組織的形成，高濃度的SNP處理則抑制愈傷組織的發(fā)生。

圖1 SNP對(duì)紅掌葉片愈傷誘導(dǎo)的影響Fig.1 Effects of SNP on callus induction of A.andraeanum leaf

表1 SNP對(duì)紅掌葉片愈傷誘導(dǎo)率和鮮重的影響Table 1 Effects of SNP on callus induction rate and fresh weight of A.andraeanum leaf

2.2 不同濃度SNP處理對(duì)不定芽分化的影響

將愈傷組織從葉片傷口處切下，轉(zhuǎn)接于不定芽分化培養(yǎng)基上，并置于光照下培養(yǎng)。愈傷組織由白色逐漸轉(zhuǎn)為綠色，紅色芽點(diǎn)從愈傷的表面產(chǎn)生，不定芽逐漸伸長(zhǎng)，展開(kāi)葉片，在不定芽的基部伴有氣生根發(fā)生（圖2）。兩個(gè)月后，愈傷表面形成叢生芽。對(duì)愈傷的分化率統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，添加20μmol/L SNP的培養(yǎng)基上，愈傷的分化率達(dá)到了100%，但與其他處理差異不顯著（表2）。對(duì)不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，在添加40μmol/L SNP的培養(yǎng)基上，不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量最多，而80μmol/L SNP處理則抑制了不定芽的發(fā)生（表2）。試驗(yàn)表明，添加SNP不能有效提高紅掌愈傷的分化率，但可以增加不定芽的數(shù)量。

圖2 不同濃度SNP處理對(duì)紅掌愈傷不定芽分化的影響Fig.2 Effects of different SNP concentration on shoots differentiation of A.andraeanum

表2 SNP對(duì)不定芽分化率和不定芽數(shù)量的影響Table 2 Effects of SNP on differentiation rate and number of shoots

2.3 不同濃度SNP處理對(duì)植株生根的影響

將不定芽從愈傷組織上切下，然后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，植株基部產(chǎn)生根源基并伸長(zhǎng)形成不定根，植株生長(zhǎng)良好（圖3）。一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)植株的生根情況，添加不同濃度的SNP均能提高紅掌植株的不定根數(shù)量，在添加20μmol/L SNP的生根培養(yǎng)基上，不定根的數(shù)量最多，且與對(duì)照差異顯著。添加不同濃度的SNP對(duì)根長(zhǎng)均沒(méi)有顯著影響（表3）。試驗(yàn)表明，SNP處理可以提高不定根的發(fā)生數(shù)量，但對(duì)不定根的長(zhǎng)度無(wú)顯著影響。

圖3 不同濃度SNP處理對(duì)植株生根的影響Fig.3 Effects of different SNP concentration on Anthurium andraeanum rooting

表3 SNP對(duì)植株生根數(shù)量和根長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of SNP on number and length of roots

3 討論

在紅掌愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加20μmol/L和40μmol/L的SNP均能顯著提高葉片的愈傷發(fā)生頻率，且添加20μmol/L的SNP使愈傷的鮮重顯著高于對(duì)照；而在添加80μmol/L的SNP愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷的發(fā)生頻率和鮮重均受到了明顯的抑制。Xu等［15］研究發(fā)現(xiàn)，SNP可以不同程度地促進(jìn)山藥（Dioscorea opposita）愈傷組織的發(fā)生頻率，其中40μmol/L SNP處理的愈傷發(fā)生頻率最高。Sarropoulou等［16］研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的SNP處理可以提高櫻桃葉片誘導(dǎo)的愈傷組織鮮重。Han等［17］研究發(fā)現(xiàn)，50μmol/L以上濃度的SNP可以抑制湖北海棠（Malus hupehensis）根誘導(dǎo)過(guò)程中愈傷組織的發(fā)生。因此，適宜濃度的SNP處理可以促進(jìn)植物愈傷組織的發(fā)生。NO參與植物體細(xì)胞脫分化的調(diào)控過(guò)程［14］，SNP促進(jìn)植物愈傷組織發(fā)生的機(jī)制可能是通過(guò)提高外植體的NO含量，誘導(dǎo)胚性愈傷組織的發(fā)生。

本研究表明，在紅掌不定芽分化培養(yǎng)基中添加不同濃度的SNP，不定芽的分化頻率沒(méi)有得到顯著提高，但是添加40μmol/L SNP可使不定芽的數(shù)量顯著提高。在其他植物中的研究同樣表明SNP具有促進(jìn)愈傷分化的作用。Han等［17］研究發(fā)現(xiàn)，30μmol/L SNP處理使湖北海棠不定芽的再生頻率和數(shù)量均顯著提高。Kalra等［18］研究發(fā)現(xiàn)，SNP可促進(jìn)大葉合歡（Albizzia lebbeck）不定芽的再生數(shù)量，與本研究一致。推測(cè)SNP是通過(guò)增加愈傷中的擬分生組織個(gè)數(shù)［19］來(lái)提高不定芽的再生數(shù)量。

本研究表明，添加不同濃度的SNP可以提高紅掌不定根的發(fā)生數(shù)量，但對(duì)根長(zhǎng)的影響不顯著。50μmol/L SNP處理使櫻桃組培苗［16］的生根數(shù)得到提高，且不同基因型間差異顯著。25μmol/L SNP處理對(duì)白菜側(cè)根的長(zhǎng)度沒(méi)有影響，但顯著提高了側(cè)根的數(shù)量［20］，這與本研究結(jié)果相似。SNP促進(jìn)植物生根的機(jī)制可能是通過(guò)提高植株基部細(xì)胞內(nèi)的NO濃度，誘導(dǎo)植物內(nèi)源生長(zhǎng)素IAA的合成，并促進(jìn)根源基的發(fā)生。