楊 珊，楊 焱，李巧珍，吳 迪，楊瑞恒，汪文翰，張赫男*

（1農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403；2上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

猴頭菌（Hericium erinareus）是我國(guó)著名的食藥用真菌，與熊掌、海參、鱉魚(yú)翅并列為“四大名菜”，并有“山珍猴頭，海味燕窩”的美稱［1］。大量研究表明，猴頭菌不僅對(duì)消化系統(tǒng)疾病具有療效，還具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、保護(hù)神經(jīng)和抗菌等作用［2］。猴頭菌的化學(xué)成分非常復(fù)雜，有多糖、甾醇類、萜類、脂肪酸、酚類等化合物，其中多糖是研究最多的成分之一。猴頭菌的主要活性物質(zhì)為猴頭多糖［3］。大量的藥理、藥效研究證明，猴頭菌子實(shí)體多糖和菌絲體多糖都具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、降血糖、抗疲勞等功效［4-8］。猴頭菌多糖現(xiàn)在主要來(lái)源于栽培的子實(shí)體和固體發(fā)酵菌絲體［9］，但菌株的退化致使其多糖含量不高且不穩(wěn)定，影響了猴頭菌類產(chǎn)品的功效與質(zhì)量，因此優(yōu)良猴頭菌株的獲得尤為重要。

物理誘變技術(shù)是微生物育種中獲得高效、高產(chǎn)菌株的重要方法之一［10］。利用物理誘變篩選高效菌株，在優(yōu)化食品微生物性能、提高其產(chǎn)品質(zhì)量方面具有廣闊的應(yīng)用前景［11］。目前，利用紫外誘變進(jìn)行微生物誘變育種研究報(bào)道最多，但紫外誘變的材料易發(fā)生光修復(fù)［12］，影響誘變結(jié)果，因此采用高效、新穎的誘變方法尤為關(guān)鍵。常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)是一種新型的誘變技術(shù)，具有誘變溫度低、無(wú)需真空環(huán)境、等離子體射流均勻等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)微生物誘變相比，操作安全性高，且對(duì)環(huán)境無(wú)污染［13］。目前，該技術(shù)主要應(yīng)用于酵母大腸桿菌及刺糖多孢菌等多種微生物的選育并取得了良好效果［14］，但在猴頭菌的選育中尚未有報(bào)道。本研究首次利用ARTP誘變技術(shù)對(duì)猴頭菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，以期獲得性狀穩(wěn)定遺傳、高產(chǎn)多糖的猴頭菌株，為猴頭菌類產(chǎn)品的深度開(kāi)發(fā)和推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試猴頭菌株0605由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 5.5。種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1 000 mL。再生培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加入甘露醇，使培養(yǎng)基中甘露醇濃度為0.6 mol/L。

1.1.3 試劑

溶壁酶購(gòu)自廣東微生物所；崩潰酶、Trolox、ABTS、TPTZ均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；七水硫酸亞鐵、氯化鈉、Tris-鹽酸、乙二胺四乙酸、苯酚、氯仿、異戊醇、甘露醇均購(gòu)自國(guó)藥試劑公司。

1.1.4 儀器

Ⅱ型ARTP誘變儀（無(wú)錫源清天木生物科有限公司）、ISG-180恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Scientic公司）、DKY-Ⅱ回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床柜（上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司）、恒溫混勻搖床（ZWY-240，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）、Allegratm25R Centrifuge離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）、FA2004N分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、SS-325高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY公司）、Veriti PCR儀（基因有限公司）、DYY-GC電泳儀（北京市六一儀器廠）、G：BOX凝膠成像儀（Syngene）、Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）、微孔板發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

1.2 方法

1.2.1 猴頭菌原生質(zhì)體制備

取PDA平板上生長(zhǎng)旺盛的猴頭菌菌絲，接種于種子培養(yǎng)基中，26℃黑暗靜止培養(yǎng)10 d。取種子培養(yǎng)基中菌絲體于離心管中，用無(wú)菌水清洗2次，濾紙吸干水分。按照每300 mg菌絲加入1 mL酶液的比例［15］置于恒溫混勻搖床中進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后采用G3砂芯漏斗過(guò)濾菌液，以除去殘留菌絲體。濾液5 000 r/min離心10 min，棄上清，所得沉淀用0.6 mol/L甘露醇穩(wěn)滲液沖洗，得到的原生質(zhì)體溶于適量的0.6 mol/L甘露醇穩(wěn)滲液中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.2 常壓室溫等離子體誘變處理時(shí)間的研究

取1×107個(gè)/mL的猴頭菌原生質(zhì)體，加入等體積的10%（V/V）甘油做保護(hù)劑，取20μL原生質(zhì)體均勻涂于載片上，置于氦氣處理源下，處理距離為2 mm，功率為120 W，氣流量為8 SLM，處理時(shí)間為0 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s。計(jì)算原生質(zhì)體在不同處理劑量下的致死率。

1.2.3 猴頭菌原生質(zhì)體ARTP誘變及優(yōu)勢(shì)菌株初篩

利用ARTP對(duì)稀釋到適當(dāng)濃度的猴頭菌原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)行輻照。輻照結(jié)束后，迅速將100μL原生質(zhì)體樣品涂布于突變體篩選平板上。試驗(yàn)在暗室中進(jìn)行，為避免光修復(fù)，使用紅光照射，每輪試驗(yàn)涂布100個(gè)平板，連續(xù)5輪。將誘變后的猴頭菌原生質(zhì)體于26℃恒溫黑暗培養(yǎng)，24 h后去黑暗繼續(xù)26℃恒溫培養(yǎng)，5 d后對(duì)再生單菌落進(jìn)行考察。每輪輻照后，以未經(jīng)過(guò)ARTP輻照的再生菌株為對(duì)照，將再生速度快、菌絲致密的優(yōu)勢(shì)再生菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，持續(xù)5代。經(jīng)過(guò)5代篩選，獲得性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定的菌株。

1.2.4 優(yōu)勢(shì)菌株的復(fù)篩

將篩選到的菌絲生長(zhǎng)速度快且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)突變菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵獲得的菌絲體經(jīng)無(wú)菌水洗滌3遍，5 000 r/min離心10 min，得到濕菌絲，冷凍干燥后獲得干菌絲，測(cè)定其生物量。搖瓶發(fā)酵所得的干菌絲經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成菌絲體粉末，與10倍體積的95%（V/V）乙醇混合靜置過(guò)夜，過(guò)夜混合物10 000 r/min離心10 min，棄上清后得到的勻漿用蒸餾水進(jìn)行稀釋，以1∶10的料液比在100℃沸水浴中提取2 h，得到的混合液10 000 r/min離心15 min并收集上清液，將離心后剩下的勻漿繼續(xù)以1∶10的料液比添加蒸餾水，在100℃沸水浴中提取2 h，反復(fù)3次［16］。將3次提取收集的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至合適的體積并加入4倍體積的95%（V/V）乙醇過(guò)夜沉淀，10 000 r/min離心15 min獲得多糖，用苯酚硫酸法對(duì)獲得的優(yōu)勢(shì)菌株菌絲胞內(nèi)多糖進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 優(yōu)勢(shì)菌株的生物學(xué)鑒定

1.2.5.1 拮抗實(shí)驗(yàn) 篩選獲得的最佳優(yōu)勢(shì)菌株和出發(fā)菌株（CK）分別取0.5 cm×0.5 cm大小菌塊一起接種到PDA培養(yǎng)基平板上，兩菌塊距離1 cm，26℃避光培養(yǎng)，2周后觀察菌株之間的拮抗反應(yīng)現(xiàn)象。

1.2.5.2 RAPD分析 用改良的CTAB法［17］提取最佳突變菌株的DNA，并對(duì)其用6條隨機(jī)引物：GGTGACGCAG（S7）、GTCCACACGG（S8）、GGAGGGTGTT（S15）、AGGGAACGAG（S17）、TTCCGAACCC（S35）、CAAACGTCGG（S39）進(jìn)行RAPD多態(tài)性擴(kuò)增和分析。RAPD-PCR擴(kuò)增總體系為25μL，包括10×buffer（含 Mg2+）2.5μL，dNTPs 2μL，引物 0.5μL，DNA模版 1μL（100 ng），Taq酶 0.5μL，ddH2O 18.5μL；RAPD-PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 優(yōu)勢(shì)菌株抗氧化能力的測(cè)定

1.2.6.1 羥基自由基清除能力的測(cè)定 羥基自由基清除能力的測(cè)定參考邵曉東等［18］的方法并加以改進(jìn)。用超純水配制0.1 mol/L Na2CO3溶液、0.05 mol/L Na2CO3溶液和0.05 mol/L NaHCO3溶液，稱取1.77 mg魯米諾加入10 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液得1 mmol/L魯米諾溶液，將0.05 mol/L NaHCO3溶液逐滴加入到0.05 mol/LNa2CO3溶液中使得混合液（碳酸鈉緩沖液CBS）的pH為8.5，配制1 mmol/L CuCl和1 mmol/L鄰菲羅啉作為反應(yīng)液。配制6%H2O2溶液為微孔板發(fā)光檢測(cè)儀泵1緩沖液，碳酸鈉緩沖液CBS∶1mmol/L魯米諾溶液為17∶1的混合液作為微孔板發(fā)光檢測(cè)儀泵2緩沖液。取溶解好的粗多糖樣品10μL并加入10μL 1 mmol/L CuCl和10μL 1 mmol/L鄰菲羅啉，放置于微孔板發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)。

1.2.6.2 Trolox等價(jià)抗氧化能力的測(cè)定 Trolox等價(jià)抗氧化能力（TEAC）的測(cè)定參考Zhang等［16］的方法。以水溶性維生素E為參照物，配制7.4 mmol/L的ABTS溶液，稱取13.2 mg過(guò)硫酸鉀加入到20 mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液中，放置暗處室溫?cái)嚢?2—16 h，產(chǎn)生暗藍(lán)綠色溶液，此溶液用PBS稀釋，得到在734 nm時(shí)吸光值為0.70的溶液。在4 h內(nèi)測(cè)定樣品的抗氧化活性，所測(cè)樣品及Trolox預(yù)先溶于PBS緩沖液中，取100μL樣品液加入到3.90 mL已反應(yīng)過(guò)的ABTS溶液中20 min后，在734 nm下測(cè)其吸光值（A）。

樣品的自由基清除能力按如下方程計(jì)算：自由基清除能力＝（1-A/A0）×100%，其中A、A0分別為溶液中存在和不存在ABTS·+自由基的吸光值。

1.2.6.3 鐵還原抗氧化離子的測(cè)定 鐵還原抗氧化能力（FRAP）的測(cè)定參考Zhang等［16］的方法。準(zhǔn)備多糖樣品溶液100μL，與新鮮的900μL FRAP試劑在37℃下混合均勻，室溫下孵育2 h。待反應(yīng)結(jié)束，設(shè)定紫外分光光度計(jì)吸收波長(zhǎng)為593 nm，測(cè)定樣品的吸光值。根據(jù)硫酸亞鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光值轉(zhuǎn)換為FRAP值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率的分析

ARTP照射時(shí)間不同，對(duì)菌體的致死率也不同［19］。如圖1所示：ARTP照射處理時(shí)間在0—30 s時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，猴頭菌原生質(zhì)體的致死率快速上升，在30 s時(shí)原生質(zhì)體致死率達(dá)到73.6%；照射時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，致死率不斷上升，在40 s時(shí)原生質(zhì)體致死率達(dá)到100%。因此，選擇照射處理時(shí)間為30 s，致死率為73.6%進(jìn)行誘變。

圖1 猴頭菌原生質(zhì)體ARTP誘變致死曲線Fig.1 ARTPmutagenic lethal curve of H.erinaceus protoplasts

2.2 ARTP誘變及優(yōu)良菌株的初篩

對(duì)猴頭菌原生質(zhì)體進(jìn)行ARTP照射處理后，以再生速度快、菌絲致密的再生菌株為篩選對(duì)象進(jìn)行傳代培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)5代傳代培養(yǎng)，獲得5株遺傳穩(wěn)定且生長(zhǎng)速度快的優(yōu)勢(shì)菌株。如表1所示，5株優(yōu)勢(shì)菌株每代的菌絲生長(zhǎng)速度均大于出發(fā)菌株（CK），且每代菌絲體生長(zhǎng)速度相對(duì)穩(wěn)定。

表1 各代猴頭菌株菌絲生長(zhǎng)速度Table 1 M ycelial grow th rate of each generation of H.erinareus

2.3 優(yōu)良菌株的復(fù)篩

為了得到性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定、高產(chǎn)胞內(nèi)多糖的猴頭菌株，以出發(fā)菌株作為對(duì)照，對(duì)初篩得到的5株優(yōu)良菌株以搖瓶發(fā)酵生物產(chǎn)量能力和菌絲體胞內(nèi)多糖含量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩。如表2所示，5株優(yōu)良菌株的生物量和胞內(nèi)多糖含量與對(duì)照相比，均有不同幅度的提高，且5株菌株的多糖含量均高于出發(fā)菌株10%以上。其中，菌株321的生物量提高率和多糖含量提高率最高，分別為30.37%和47.45%。

表2 ARTP誘變對(duì)猴頭菌株菌絲發(fā)酵生物量和胞內(nèi)多糖含量的影響Table 2 Effects of ARTPmutagenesis on m ycelial fermentation biomass and intracellular polysaccharide content of H.erinareus

2.4 突變菌株的生物學(xué)鑒定

2.4.1 拮抗實(shí)驗(yàn)

菌絲之間的拮抗反應(yīng)是菌株間遺傳特性不同的重要表現(xiàn)，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，株系間的拮抗越強(qiáng)［20］。如圖2所示，菌株321與出發(fā)菌株（CK）之間產(chǎn)生了明顯的拮抗線，表明兩菌株生長(zhǎng)相互抑制，且菌株321與出發(fā)菌株相比有顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。該結(jié)果暗示ARTP輻照猴頭菌原生質(zhì)體可能使其遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變。

2.4.2 RAPD分析

RAPD分析具有時(shí)間短、效率高和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以在整個(gè)基因組DNA水平上分析不同菌株的親緣關(guān)系［21］。如圖3所示，菌株321與出發(fā)菌株（CK）的電泳圖譜相比較，RAPD多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)了不同程度的差異，從分子水平上證實(shí)了菌株321的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，表明菌株321為突變新菌株。

圖2 菌株321與出發(fā)菌株（CK）的拮抗實(shí)驗(yàn)Fig.2 Antagonistic experiment between original strain（CK）and strain 321

圖3 菌株321的RAPD電泳圖譜Fig.3 RAPD electrophoretogram of strain 321

2.5 ARTP輻照對(duì)猴頭菌菌絲體多糖抗氧化活性的影響

2.5.1 誘變前后猴頭菌菌絲多糖羥基自由基清除能力的比較

為了考察ARTP誘變對(duì)猴頭菌菌絲體多糖羥基自由基清除能力的影響，對(duì)菌株321菌絲體多糖和出發(fā)菌株菌絲體多糖進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示：菌株321菌絲體胞內(nèi)多糖羥基自由基清除率為42.86%，出發(fā)菌株菌絲體胞內(nèi)多糖羥基自由基清除率為27.72%。試驗(yàn)表明，優(yōu)勢(shì)菌株321菌絲體胞內(nèi)多糖和出發(fā)菌株菌絲體胞內(nèi)多糖對(duì)羥基自由基均有清除作用，但優(yōu)勢(shì)菌株321菌絲體胞內(nèi)多糖的羥基自由基清除能力強(qiáng)于出發(fā)菌株，提高了54.7%，表現(xiàn)出了更強(qiáng)的羥基自由基清除能力。

2.5.2 誘變前后猴頭菌絲多糖TEAC和FRAP比較

為了考察ARTP誘變對(duì)猴頭菌菌絲體多糖總抗氧化能力和Fe2+還原能力的影響，對(duì)菌株321和出發(fā)菌株的菌絲體多糖進(jìn)行了比較。從圖4可以看出，出發(fā)菌株（CK）和優(yōu)勢(shì)菌株321菌絲體胞內(nèi)粗多糖都具有抗氧化能力，但優(yōu)勢(shì)菌株321菌絲體胞內(nèi)粗多糖抗氧化（TEAC和FRAP）能力均大于出發(fā)菌株。優(yōu)勢(shì)菌株321對(duì)Fe2+還原及清除ABTS·+自由基的能力分別為14.75μmol Fe2+/g和132.81μmol Trolox/g，分別較出發(fā)菌株提高了19.7%和26.8%，表明優(yōu)勢(shì)菌株321菌絲體胞內(nèi)多糖比出發(fā)菌株具有更強(qiáng)的抗氧化作用。

圖4 菌株321與出發(fā)菌株（CK）的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant ability of strain 321 and original strain（CK）

3 討論

猴頭菌具有多種顯著的藥理活性，近年來(lái)被眾多學(xué)者廣泛研究，其營(yíng)養(yǎng)保健作用也日益被消費(fèi)者所熟知，市場(chǎng)相關(guān)產(chǎn)品也越來(lái)越多，如猴菇餅干、猴菇米稀、猴菇飲料等。研究表明，猴頭菌類產(chǎn)品中發(fā)揮主要活性作用的是猴頭多糖［22］。因此，通過(guò)菌種選育獲得可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)多糖猴頭菌株，對(duì)進(jìn)一步拓展猴頭菌資源的開(kāi)發(fā)和利用是非常有意義的。常壓室溫等離子體誘變作為一種新興的誘變方法，在一定程度上較好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)誘變熱點(diǎn)鈍化的缺陷［23］。王楠等［24］利用紫外誘變猴頭菌得到一個(gè)優(yōu)勢(shì)突變菌株，該菌株與出發(fā)菌株相比生物量和菌絲體多糖含量分別提高了9.00%和28.88%。本研究將ARTP應(yīng)用于猴頭菌株顯示了良好的誘變效果，經(jīng)篩選獲得5株性狀穩(wěn)定的優(yōu)良突變菌株，搖瓶發(fā)酵菌絲干重和菌絲體胞內(nèi)多糖含量與對(duì)照相比均有不同程度的提高，其中菌株321的生產(chǎn)能力表現(xiàn)最佳，生物量和多糖含量分別提高了30.37%和47.45%。研究結(jié)果顯示，篩選獲得優(yōu)勢(shì)突變菌株的單位菌絲干重對(duì)應(yīng)的多糖含量不盡相同，暗示ARTP的作用機(jī)制可能比較復(fù)雜，推測(cè)其糖生物合成途徑可能受到了影響，糖代謝途徑也可能受到了影響。拮抗實(shí)驗(yàn)和RAPD分析證實(shí)，菌株321遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，為突變新菌株。RAPD分析結(jié)果同時(shí)暗示ARTP誘變可以導(dǎo)致出發(fā)菌株細(xì)胞DNA發(fā)生多位點(diǎn)突變。抗氧化結(jié)果顯示，突變菌株321的體外抗氧化能力和羥基自由基清除能力均優(yōu)于出發(fā)菌株，表明ARTP誘變不僅可以促進(jìn)猴頭菌株生產(chǎn)能力的提高，也可以提高菌絲體胞內(nèi)多糖的抗氧化活性。綜上，ARTP是一種高效的誘變技術(shù)，本研究通過(guò)利用ARTP誘變選育獲得了高產(chǎn)胞內(nèi)多糖猴頭菌株，為猴頭資源更好的開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為ARTP誘變技術(shù)應(yīng)用于其他擔(dān)子菌提供了依據(jù)。