謝留杰，段 敏，曾國應，黃善軍，潘曉飚*

（浙江省臺州市農(nóng)業(yè)科學研究院，臺州317000；2湖南亞華種業(yè)科學研究院，長沙410000）

兩系法雜交水稻育種技術(shù)開創(chuàng)了另一條雜種優(yōu)勢利用的途徑，并正逐步取代三系法成為生產(chǎn)上應用最廣泛的雜種優(yōu)勢利用技術(shù)［1-2］。水稻雜交制種是通過雄性不育系與恢復系異交生產(chǎn)種子的技術(shù)，制種產(chǎn)量直接關(guān)系到不育系的利用價值及配制組合的推廣前景［3］。不育系的異交特性是指在非人工條件下植株特性、花器官構(gòu)造、開花習性等影響接受外源花粉而受精結(jié)實的能力。前人對兩用核不育系的異交特性開展了大量研究［4-7］，一般都認為柱頭外露率和午前開花比率是影響異交結(jié)實率的重要指標。但是，影響異交結(jié)實率的因子紛繁復雜，除去氣候環(huán)境的外在因素，不育系的內(nèi)在因素之間存在相互影響、相互制約的關(guān)系。為了準確掌握影響異交結(jié)實率的規(guī)律，需要全面系統(tǒng)地分析所有異交相關(guān)的性狀。

本研究對8個秈稻兩用核不育系的花器性狀和異交特性進行研究，并進行相關(guān)性狀與異交結(jié)實率的統(tǒng)計分析，旨在探索影響異交結(jié)實率的關(guān)鍵因子，為高異交率不育系選育和高產(chǎn)制種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為8個秈稻兩用核不育系水稻［8］，包括4個早秈型：湘陵628S、湘陵750S、株1S、陸18S；4個晚秈型：1892S、Y58S、深08S、培矮64S；制種父本為晚秈稻ST500。

1.2 試驗方法

1.2.1 柱頭活力鑒定

試驗于2017年秋季在臺州市農(nóng)業(yè)科學研究院試驗基地開展。不育系齊穗后，每個不育系一次性選取24個穗并進行剪穎，每穗單獨用牛皮紙?zhí)状?。剪穎當天開始，每天各不育系分別選取3個剪穎套袋的單穗進行充分授粉，連續(xù)進行8 d，授粉后的第20天分別調(diào)查各穗結(jié)實率。為排除天氣因素的干擾，試驗在天氣晴朗的9月5日和6日進行剪穎，隨后每天上午9：30左右取穗，浸水后夾在書中，使稻穗集中開花，母本授粉充足。

柱頭活力系數(shù)（Stigma activity coefficient，SAC）＝第2天至第4天授粉結(jié)實率之和/第2天授粉結(jié)實率。

1.2.2 柱頭長度、寬度、面積測量

選取發(fā)育完整的穎花3枚（6個柱頭），放置于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下拍攝柱頭圖片。以血球計數(shù)板刻度為標尺，利用ImageJ軟件測量柱頭長度（Stigma length，SL）、寬度（Stigma wide，SW）和面積（Stigma area，SA）。

1.2.3 開穎角度、開穎時間和柱頭外露率調(diào)查

挑選10朵穎花，用量角器測量穎花張開角度（Glume opening angle，GOA），同時記錄穎花張開持續(xù)時間，即開穎時間（Glume opening time，GOT）。

始花期選擇5個主穗，每日調(diào)查柱頭外露穎花數(shù)以及開花總數(shù)，截止開花結(jié)束，統(tǒng)計柱頭外露率（Stigma exsertion rate，SER）。

1.2.4 午前開花率（Flowering rate before noon，F(xiàn)RBN）

在晴朗天氣下，每個不育系選擇5穗，上午開花時每隔1 h記錄一次開花數(shù)目，直至開花結(jié)束，統(tǒng)計12：00之前開花穎數(shù)占當天總開花穎數(shù)的比例。

1.2.5 不育系制種條件下異交結(jié)實率調(diào)查

對供試的8份材料進行分期播種，父本ST500在5月30日播種，依據(jù)制種父本材料的花期，選出花期相同的不育系材料，移至制種田中。人工趕粉，結(jié)束20 d后調(diào)查異交結(jié)實率（Out crossing rate，OR）。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0進行相關(guān)性分析和通徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 8個秈稻兩用核不育系的柱頭活力表現(xiàn)

如表1所示，從授粉第2天開始，隨著授粉日期的延遲，8個秈稻兩用核不育系的結(jié)實率均出現(xiàn)明顯下降。第7天授粉后，1892S結(jié)實率最高達3.13%，陸18S和深08S次之。不育系湘陵750S出現(xiàn)第2天（63.22%）授粉結(jié)實率高于第1天（48.63%）現(xiàn)象，可能是剪穎當天某些底部較嫩未能開花，柱頭被花藥包住降低了結(jié)實率?？紤]第1天的結(jié)實率受到柱頭活力之外的因素影響，本研究將第2天的結(jié)實率作為柱頭活力系數(shù)計算的參照。柱頭活力系數(shù)分析結(jié)果表明，供試的不育系柱頭活力在1.92—2.44，陸18S和1892S柱頭活力系數(shù)最高，湘陵628S柱頭活力系數(shù)最低。異交結(jié)實率表現(xiàn)最好的是1892S，達到48.49%，其次是深08S（37.21%）和培矮64S（35.54%），而株1S、湘陵628S、湘陵750S和陸18S的異交率相對較低，不超過30%。供試材料中，晚秈型不育系的異交結(jié)實率明顯高于早秈型。

綜合分析不同天數(shù)的結(jié)實率、柱頭活力和異交結(jié)實率發(fā)現(xiàn)，1892S和深08S的柱頭活力系數(shù)屬于相對中上水平，在參試水稻不育系中異交結(jié)實率較高；柱頭活力最低的兩個水稻不育系是湘陵628和Y58S，但其異交結(jié)實率表現(xiàn)并非最差。從上述結(jié)果看出，水稻兩用核不育系的異交結(jié)實率與柱頭活力之間無明顯因果關(guān)系，柱頭活力系數(shù)的變異范圍不大，該性狀對異交結(jié)實率的影響有限。

表1 水稻不育系柱頭活力系數(shù)及異交結(jié)實率Table1 Stigma activity coefficient and out crossing rate of 8 rice sterile lines

2.2 秈稻兩用核不育系的柱頭形態(tài)特征

如表2所示，株1S、1892S和深08S的柱頭長度較大，分別為1.80 mm、1.42 mm和1.38 mm；陸18S和Y58S柱頭較短，分別為0.98 mm和0.95 mm。供試的8個水稻不育系柱頭寬、柱頭面積與柱頭長呈現(xiàn)出相同的趨勢，即株1S＞1892S＞深08S＞湘陵628S＞培矮64S＞湘陵750S＞陸18S＞Y58S。株1S的柱頭性狀明顯優(yōu)于其他不育系，差異達到極顯著水平。

表2 水稻不育系的柱頭性狀Table 2 Stigma traits of 8 rice sterile lines

2.3 秈稻兩用核不育系異交結(jié)實率和花器官特性、開花習性的相關(guān)性分析

從表3可以看出，與異交結(jié)實率相關(guān)性系數(shù)最高的是開穎時間，達到極顯著水平（0.839**）；柱頭總外露率與異交結(jié)實率的相關(guān)性也達顯著水平（0.744*）。其他性狀與異交結(jié)實率的相關(guān)系數(shù)均未達到顯著水平。柱頭活力一直被看作是影響異交結(jié)實率的重要因子，本研究中參試品系柱頭活力的變異范圍在1.92—2.44。不育系之間差異不大，柱頭活力和異交結(jié)實率呈現(xiàn)出不顯著的關(guān)系。

表3 水稻不育系花器官性狀與異交結(jié)實率的相關(guān)性系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between floral organ traits and outcrossing rate of 8 rice sterile lines

此外，柱頭外露率和開穎時間的相關(guān)性也達到了顯著水平（0.728*），考慮到異交結(jié)實率受到開穎時間和柱頭外露率的影響，進一步對異交結(jié)實率與這2個性狀進行偏相關(guān)分析。結(jié)果顯示，異交結(jié)實率與開穎時間的偏相關(guān)系數(shù)為0.640，與柱頭外露率的偏相關(guān)系數(shù)為0.383。根據(jù)偏相關(guān)分析結(jié)果，水稻兩用核不育系的開穎時間和柱頭外露率是影響異交結(jié)實率的2個重要性狀，其中開穎時間比柱頭外露率與異交結(jié)實率的相關(guān)性更為密切。

2.4 秈稻兩用核不育系異交結(jié)實率的回歸方程及通徑分析

本試驗供試材料n＝8，屬于小項目樣本。利用SPSS 19.0軟件，選擇Shapiro-Wilk對異交結(jié)實率進行正態(tài)性檢驗，結(jié)果顯示：異交結(jié)實率（因變量）統(tǒng)計量為0.858，顯著水平P為0.114，大于0.05。因變量異交結(jié)實率（y）分布接近正態(tài)分布，可以用于回歸分析。

利用回歸分析的線性方法分析，選擇開穎時間（x1）、柱頭外露率（x2）、柱頭長（x3）、開穎角度（x4）、柱頭活力系數(shù)（x5）正向相關(guān)性狀為自變量，建立的模型的相關(guān)系數(shù)R、決策系數(shù)R2分別為0.926、0.858。因此，該模型能夠較為全面地考慮到因變量的作用因子。異交結(jié)實率的回歸方程為：y＝-53.709+0.269x1+0.137x2+10.241x3+0.730x4+5.060x5。

依據(jù)通徑分析的結(jié)果，異交結(jié)實率與開穎時間的直接通徑系數(shù)高達0.662，通過其他性狀影響異交結(jié)實率的間接通徑系數(shù)為0.254；與柱頭外露率的直接通徑系數(shù)僅為0.182，通過其他性狀影響異交結(jié)實率的間接通徑系數(shù)為0.571；與柱頭長度的直接通徑系數(shù)為0.291，間接通徑系數(shù)為-0.061；與開穎角度的直接通徑系數(shù)為0.270，間接通徑系數(shù)為0.216；與柱頭活力系數(shù)的直接通徑系數(shù)為0.099，間接通徑系數(shù)為0.237，且通過開穎時間的間接系數(shù)為0.482。綜合所有性狀可以得出，水稻兩用核不育系影響異交結(jié)實率的主要因素為開穎時間和柱頭外露率，柱頭外露率的間接通徑系數(shù)的0.482是開穎時間的貢獻；其他性狀如柱頭長度和開穎角度的優(yōu)化，也可以提高異交結(jié)實率；柱頭活力對異交結(jié)實率的影響不顯著。

3 討論

雜交水稻種子生產(chǎn)中，花器官的構(gòu)造及開花特性直接決定制種產(chǎn)量的高低。研究表明，水稻不育系的柱頭外露率、柱頭長度直接影響異交結(jié)實率的高低［5，8-10］；關(guān)于午前開花率與異交結(jié)實率，有研究報道存在顯著相關(guān)，也有研究表明兩者之間并無直接聯(lián)系［11-12］；柱頭活力與異交結(jié)實率沒有必然關(guān)系［5］。本研究通過對包括開穎時間在內(nèi)的8個性狀進行相關(guān)分析，結(jié)果表明：柱頭外露率與異交結(jié)實率存在顯著的相關(guān)性；開穎時間與異交結(jié)實率相關(guān)性達到了極顯著水平，偏相關(guān)系數(shù)達到0.640，遠高于柱頭外露率的0.383。通徑分析表明，開穎時間對于異交結(jié)實率的直接通徑系數(shù)高于柱頭外露率。目前，關(guān)于開穎時間與異交結(jié)實率相關(guān)性的研究較少，一般認為開穎時間越長，異交結(jié)實率越高，但沒有被作為影響異交結(jié)實率的主要因子。本研究表明，在高異交率的水稻不育系選育中，需提高柱頭外露率，同時要適當延長開穎時間。供試的8個秈稻不育系中，4個早秈型不育系的異交結(jié)實率明顯低于晚秈型，原因可能是開穎時間相對較短。

本研究中有2個性狀與異交結(jié)實率相關(guān)系數(shù)為負值，柱頭寬度與異交結(jié)實率相關(guān)系數(shù)為-0.15，這與前人研究［13］及常規(guī)推理存在矛盾。不育系株1S和湘陵750S的柱頭寬度最大為0.64和0.47，這2個不育系屬于早秈型，其開穎時間不長、柱頭外露率不高，在這2個關(guān)鍵因子的作用下使得最后與異交相關(guān)系數(shù)為負值。午前開花率亦是如此，它與異交結(jié)實率也存在負相關(guān)（-0.075），主要原因也是早秈型的午前花率相對較高，而其異交結(jié)實率比晚秈型低。此外，幾個早秈型不育系開花時間較早，開花最早的湘陵628S早上8：00之前有11.89%開花［6］，其開穎時間又相對較短，在父本開花之前，已經(jīng)有部分穎花閉合，最終導致異交結(jié)實率不高。從4個早秈型不育系比較來看，開穎時間和柱頭外露率處于同等水平，株1S的柱頭長、寬度最高，其異交結(jié)實率也最大。本研究中的8個水稻不育系是生產(chǎn)上應用較為廣泛的不育系類型，午前開花時間均較早（超過83%），品系之間的差異不明顯，得出的結(jié)論可能存在局限性。

李維明等［14］研究表明，柱頭相關(guān)的性狀大都具備遺傳力較高的特性，并且柱頭外露率、開穎時間等性狀優(yōu)良的資源比較豐富，可以通過遺傳改良來提升水稻不育系的異交特性。結(jié)合本研究的結(jié)果，筆者認為秈稻兩用核不育系選育過程中，重點關(guān)注開穎時間和柱頭外露率2個重要指標的選擇；其次，柱頭長度、開穎角度以及柱頭活力等指標也應當進一步優(yōu)化。同時，在制種環(huán)節(jié)上要合理安排花期，通過割葉、人工趕粉、噴施赤霉素等措施，充分發(fā)揮秈稻兩用核不育系的高產(chǎn)制種潛力。