黃 鶯

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院) 藥劑科，安徽 合肥 230001)

白血病(leukemia)是一種異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，受累細(xì)胞(白血病細(xì)胞)出現(xiàn)增殖失控、分化障礙、凋亡受阻，大量蓄積于骨髓和其他造血組織，從而抑制骨髓正常造血功能并浸潤(rùn)淋巴結(jié)、肝、脾等組織器官[1].白血病的全球發(fā)病率在2.76/10萬人左右，約占癌癥總發(fā)病數(shù)的5%.成人以急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)為主，兒童以急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)為主[2].近年來，盡管生物技術(shù)手段和臨床治療水平均得到了極大發(fā)展，但是白血病的治療和預(yù)后仍不如人意，5年生存率只有約19.6%[3].隨著基因組學(xué)的發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)片段非編碼RNA(long ncRNAs，簡(jiǎn)稱lncRNAs)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極為重要的作用，其與多種生物學(xué)過程密切相關(guān)，具有成為腫瘤診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物的潛力[4].位于人類5號(hào)染色體上的煙酰胺核苷酸反義轉(zhuǎn)氫酶RNA1(NNT-AS1)，是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA[5].大量體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，NNT-AS1在胃癌、肝細(xì)胞癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌等腫瘤組織中呈異常高表達(dá)，且能通過調(diào)控MAPK/ERK、miR-363/CDK6等信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，簡(jiǎn)稱EMT)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等[6-7].但NNT-AS1在白血病中的作用尚未見研究報(bào)道.因此，筆者選用白血病細(xì)胞株Raji細(xì)胞，考察LncRNA NNT-AS1對(duì)白血病Raji細(xì)胞增殖、侵襲的影響及其作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人白血病細(xì)胞株Raji細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞研究所.

1.2 試劑與儀器

胎牛血清(批號(hào)：10099151)、RPMI1640培養(yǎng)基(批號(hào)：SH30814.01B)購自美國Gibco公司；CCK-8(批號(hào)：20170015)購自南京建成生物科技有限公司；羅丹明-123(Rhodamine-123，Rh-123，批號(hào)：G1124)、qRT-PCR試劑盒(批號(hào)：A1852)均購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；抗β-actin(批號(hào)：AM1021B)、MMP-2(批號(hào)：630236)、MMP-9(批號(hào)：641509)、VEGF(批號(hào)：557007)單抗均購自美國CST公司；Kpn I(批號(hào)：D1068A)、EcoR I(批號(hào)：D1048A)、BamH I(批號(hào)：D1010A)均購自日本Takara公司；質(zhì)粒小提試劑盒(批號(hào)：AP-MN-P-250)，購自美國AXYGEN公司.實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀(Multiskan MK3)、PCR儀(Piko Real PCR)購自美國Thermo公司.

1.3 Raji穩(wěn)定干擾細(xì)胞系的建立

(1)構(gòu)建慢病毒干擾載體 pLenR-GPH-hNNT-AS1-sh：通過干擾靶點(diǎn)序列、退火、酶切、重組質(zhì)粒和慢病毒包裝、濃縮等5個(gè)步驟，建立 hNNT-AS1-sh 慢病毒載體；(2)將構(gòu)建好的hNNT-AS1-sh 慢病毒(8 μL)和對(duì)照慢病毒(6 μL)轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞(細(xì)胞種于24孔板，濃度4×104/mL，感染指數(shù)(multiplicity of infection，簡(jiǎn)稱MOI)為10)中；(3)待病毒感染8 h后，棄去上清，更換培養(yǎng)液；(4)待病毒感染96 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果；利用2 μg·μL-1嘌呤霉素進(jìn)行篩選，待轉(zhuǎn)染率達(dá)80%以上時(shí)，將穩(wěn)定干擾NNT-AS1表達(dá)的Raji 細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系繼續(xù)傳代培養(yǎng)3～4代后進(jìn)行試驗(yàn).

1.4 CCK-8法測(cè)定增殖

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji/NNT-AS1 shRNA、Raji/GPH及Raji細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL加入96孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜.分別在培養(yǎng)24，48，72，96 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，振蕩，避光孵育30 min，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光值.

1.5 遷移實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji/NNT-AS1 shRNA、Raji/GPH及Raji細(xì)胞，1 000 r·min-1×5 min離心，棄上清，用RPMI-1640培養(yǎng)基(不含血清)洗細(xì)胞1遍(目的是去除血清).RPMI-1640培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL.先在24孔板中加入500 μL培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，再將Transwell小室放入24孔板中，于上室用槍加入細(xì)胞懸液200 μL，5%CO2、37 ℃條件下孵育24 h.將Transwell小室取出，吸取各孔內(nèi)的細(xì)胞，1 000 r·min-1×5 min離心，標(biāo)記好后，每孔細(xì)胞分別加入100 μL培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，重懸后接種于96孔板中，再加入CCK-8 10 μL/孔，37 ℃孵育1 h，上機(jī)檢測(cè)各孔吸光值.

1.6 侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell小室滅菌后，放入24孔板中，將液體Matrigel基質(zhì)膠(1∶5稀釋)于冰盒上加入Transwell小室中，每室50 μL，輕搖使膠均勻鋪平，37 ℃孵育過夜，使膠凝固. 加入細(xì)胞步驟參考1.5遷移實(shí)驗(yàn)；孵育24 h后，取出小室，棄去上室液體，待小室風(fēng)干后，將小室浸入提前配制好的4%多聚甲醛中30 min，再放入Giemsa染液(1∶9稀釋)中37 ℃染色 10～15 min，PBS沖洗幾遍，在顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算細(xì)胞數(shù)目.

1.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)

采用 BCA 蛋白定量法測(cè)定MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白： 按BCA試劑盒說明書，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔，樣本孔.加入BCA 工作液后37 ℃下孵育30 min，上機(jī)檢測(cè).依據(jù)測(cè)得的蛋白濃度，在樣本中加入適量的上樣緩沖液，吹打均勻后，放入沸水中10 min使蛋白變性，置于—20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?制備聚丙烯凝膠，每孔加樣品10 μL，電泳分離1.5 h，分離完畢后切膠，轉(zhuǎn)膜2 h(冰水中).脫脂奶粉封閉 2 h.取出封閉的膜，TPBS洗3次，然后用PBS洗1次；一抗(MMP-2、MMP-9和VEGF，1∶500)常溫孵育12 h，TPBS 洗3次，二抗 (1∶50 000)5%，TPBS洗3次，PBS 洗1次；以上洗膜時(shí)間均為每次10 min.上機(jī)顯影，配置適量顯影液(配好的顯影液需避光)，用槍均勻地加在條帶上；利用凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image-Pro Plus軟件分析.

1.8 RT-PCR檢測(cè)NNT-AS1基因的mRNA水平

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji/NNT-AS1 shRNA、Raji/GPH及Raji細(xì)胞，向試驗(yàn)孔中加入10 μmol·L-1TPL，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，消化收集細(xì)胞；用Trizol法提取各組總RNA，用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA.NNT-AS1上游引物序列：5′-TGAAGTTTTCAGGGACACAT-3′，下游引物序列：5′-TTTAGACCTGTTTCTTTGTT-3′；94 ℃變性3 min后，按下述條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)后72 ℃延伸5 min.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

利用限制性內(nèi)切酶EcoRI(位于4 620 bp)和KpnI(位于4 290 bp)將重組質(zhì)粒及空載體進(jìn)行酶切鑒定，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(空載體酶切序列為331 bp，shRNA載體酶切序列為396 bp)，結(jié)果如圖1所示.

A：M2000；B：GPH-NC；C：GPH；D：GPH-NNT-AS1-SH1.圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 成功構(gòu)建NNT-AS1穩(wěn)定低表達(dá)的Raji細(xì)胞系

將構(gòu)建成功的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相應(yīng)的Raji細(xì)胞后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，鏡下觀察并拍照，結(jié)果如圖2所示.

(a1)、(a2)為Raji組，(b1)、(b2)為Raji/GPH組，(c1)、(c2)為Raji/NNT-AS1 shRNA組；(a1)、(b1)、(c1)為3組細(xì)胞的白光照片；(a2)、(b2)、(c2)分別為(a1)、(b1)、(c1)對(duì)應(yīng)的同一視野的熒光照片.圖2 轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光觀察(×200倍)

圖2的結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染的Raji組細(xì)胞中無任何熒光信號(hào)，而Raji/GPH 組和Raji/NNT-AS1 shRNA組細(xì)胞中均可見強(qiáng)綠色熒光，且含熒光細(xì)胞數(shù)達(dá)80%，表明轉(zhuǎn)染成功.

2.3 qRT-PCR 檢測(cè)NNT-AS1 mRNA 水平

qRT-PCR檢測(cè)NNT-AS1 mRNA水平，結(jié)果如圖3所示.

A為Raji組；B為Raji/GPH組；C為Raji/NNT-AS1 shRNA組;**表示與Raji組相比p<0.01；##表示與Raji/GPH組相比p<0.01.圖3 NNT-AS1 mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖(a)；qRT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中 的NNT-AS1 mRNA 表達(dá)(b)

RNA電泳結(jié)果顯示(圖3(a))，18S和28S條帶均清楚可見，且無拖尾現(xiàn)象，表明該次提取的NNT-AS1 mRNA的結(jié)構(gòu)完整.qRT-PCR統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(圖3(b))，與Raji/GPH 組和Raji組相比，Raji/NNT-AS1 shRNA組細(xì)胞中NNT-AS1 mRNA明顯下降(p<0.001).

2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Raji/NNT-AS1 shRNA、Raji/GPH和Raji 3組細(xì)胞的增殖，結(jié)果如圖4所示.

圖4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

圖4顯示，Raji/NNT-AS1 shRNA、Raji/GPH和Raji 3組細(xì)胞在第1天時(shí)增殖情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而第2～5 天，Raji/NNT-AS1 shRNA 組細(xì)胞增殖速率明顯低于Raji/GPH組(p<0.01)和Raji組(p<0.01)，表明下調(diào) NNT-AS1的表達(dá)可抑制Raji細(xì)胞的增殖.

2.5 遷移實(shí)驗(yàn)

Raji/NNT-AS1 shRNA、Raji/GPH和Raji 3組細(xì)胞的遷移結(jié)果如圖5所示.

與Raji組相比，**p<0.01；與Raji/GPH組相比，##p<0.01.圖5 各組細(xì)胞遷移能力比較

圖5顯示，與Raji/GPH組及Raji組相比，Raji/NNT-AS1 shRNA組遷移細(xì)胞數(shù)明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均p<0.01).提示下調(diào)NNT-AS1的表達(dá)，可抑制Raji細(xì)胞的遷移.

2.6 侵襲實(shí)驗(yàn)

Raji/NNT-AS1 shRNA、Raji/GPH和Raji 3組細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)經(jīng)過Giemsa 染色和計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖6～7所示.

(a)為Raji組；(b)為Raji/GPH組；(c)為Raji/NNT-AS1 shRNA組.圖6 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力(×200倍)

**表示與Raji組相比，p<0.01；##表示與Raji/GPH組相比，p<0.01.圖7 各組侵襲細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

Giemsa染色和計(jì)數(shù)結(jié)果顯示(圖6～7)，與Raji/GPH組及Raji 組相比，Raji/NNT-AS1 shRNA 組細(xì)胞穿透基質(zhì)膠數(shù)目明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01).提示下調(diào)NNT-AS1的表達(dá)，可抑制Raji細(xì)胞的侵襲.

2.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)

Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖8所示.

(a)為各蛋白Western blot蛋白條帶結(jié)果；(b)為各目標(biāo)蛋白MMP-2、MMP-9和VEGF與β-actin的熒光強(qiáng)度相對(duì)值(以β-actin熒光強(qiáng)度為1)，**表示與Raji組相比，p<0.01；##表示與Raji/GPH組相比， p<0.01.圖8 Western Blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)

圖8的Western blot結(jié)果顯示，Raji/GPH組及Raji 組相比，Raji/NNT-AS1 shRNA 組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)明顯減少.

3 討 論

LncRNA是功能性RNA的一種，其不具備編碼蛋白質(zhì)功能，長(zhǎng)度一般超過200 nt，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布，主要用于調(diào)控基因的表達(dá)[8].近年來，隨著對(duì)LncRNA研究的不斷深入，大量的證據(jù)顯示LncRNA與機(jī)體的多種生物過程有關(guān)，尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，LncRNA有潛力成為腫瘤標(biāo)記物[9-10].在已發(fā)現(xiàn)的LncRNA中，有許多已被證實(shí)與白血病相關(guān)：國外研究發(fā)現(xiàn)，與AML低危組相比，高危組患者組織中LncRNA IRAIN表達(dá)量明顯降低，而LncRNA IGF1R表達(dá)明顯升高[11-12]；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，AML與腫瘤抑制基因LncRNA-MEG3發(fā)生甲基化關(guān)系密切，可能是AML患者潛在的治療靶點(diǎn)[13].國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)LncRNA KCNQ1OT1在急性髓系白血病(AML)患者外周血樣本呈現(xiàn)高表達(dá)，可能成為AML患者預(yù)后潛在的標(biāo)志物[14].李正等[15]通過QT-PCR發(fā)現(xiàn)lncRNA-LLEST 在AML初期呈低表達(dá)，當(dāng)化療藥物誘導(dǎo)后LLEST表達(dá)出現(xiàn)明顯升高，且LLEST表達(dá)越高，AML患者預(yù)后越佳，提示LLEST具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用.

筆者所考察的LncRNA NNT-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，其位于人5號(hào)染色體上.大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患者的病理組織中LncRNA NNT-AS1呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，探究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，LncRNA NNT-AS1主要是通過激活腫瘤細(xì)胞MAPK/ERK信號(hào)通路和促進(jìn)其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，使腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[16].同時(shí)也有研究表明，肝細(xì)胞癌(HCC)患者組織中LncRNA NNTAS1也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其主要是通過調(diào)控miR-363 /CDK6信號(hào)通路參與HCC發(fā)生發(fā)展[17].另外，LncRNA NNT-AS1與骨肉瘤的發(fā)生也密切相關(guān)，與對(duì)照組相比，LncRNA NNT-AS1高表達(dá)組患者的生存率和生存時(shí)間明顯減少[18].筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NNT-AS1在白血病細(xì)胞中的表達(dá)較正常淋巴細(xì)胞明顯升高，與上述報(bào)道的其他惡性腫瘤結(jié)果一致，考慮其也可能在白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.為進(jìn)一步考察其對(duì)白血病細(xì)胞的影響，筆者通過基因沉默技術(shù)以降低LncRNA NNT-AS1在Raji細(xì)胞中的表達(dá)，再利用Q-PCR、CCK-8、Transwell、Westren blot等實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)下調(diào)LncRNA NNT-AS1表達(dá)后，Raji細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化，并初步探究其可能的機(jī)制.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Raji/GPH組及Raji組相比，Raji/NNT-AS1 shRNA組細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力均顯著下降，同時(shí)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)水平也明顯降低.

綜上所述，下調(diào)LncRNA TTN-AS1表達(dá)可降低白血病Raji細(xì)胞增殖、侵襲能力，其機(jī)制可能與其下調(diào)Raji細(xì)胞的MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白表達(dá)有關(guān)，提示LncRNA TTN-AS1可能是治療白血病新的基因靶點(diǎn)，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.