邵天賜，何優(yōu)，張楓凱，蔡劉滕子，田艷杰，周晨妍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省合成生物學(xué)工程實驗室，河南 新鄉(xiāng)，453003)

木聚糖是由D-木糖通過β-1,4-糖苷鍵相連成的主鏈和少量L-阿拉伯糖和葡萄糖醛酸等構(gòu)成的側(cè)鏈所組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的不均一聚糖[1]。由于木聚糖資源以復(fù)雜的結(jié)構(gòu)存在，而無法被人類直接利用，從而迫使人們積極尋找可利用木聚糖資源的途徑[2]。木聚糖酶(xylanase)是指一類能專一降解木聚糖的多功能酶的總稱[3-5]。絕大多數(shù)微生物都能利用木聚糖，目前所知，細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母菌、藻類以及動物瘤胃中的細(xì)菌等大多數(shù)微生物都能產(chǎn)木聚糖酶[6-8]。木聚糖酶(EC3.2.1.8)作為木聚糖的主要降解酶，廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，不同的應(yīng)用領(lǐng)域需要對應(yīng)不同特性的木聚糖酶[9-11]。

合成生物學(xué)是運用工程化設(shè)計理念，對所選生物體進行目的性設(shè)計、改造乃至重新合成[12-13]，創(chuàng)建賦予非自然功能的"人造生命"，在生物技術(shù)顛覆式創(chuàng)新方面展現(xiàn)了無限的潛力。分子酶學(xué)工程是21世紀(jì)生命科學(xué)以及生物技術(shù)的重要領(lǐng)域。分子酶學(xué)工程研究是采用計算設(shè)計以及實驗驗證2種學(xué)科交叉的方法，獲得具有特定性質(zhì)和功能的生物大分子[14-15]。本研究采用合成生物學(xué)思路，以黑曲霉XZ-3S木聚糖酶XynZF-2基因序列為基礎(chǔ)，將N端48個氨基酸替換成EvXyn11 N端的34個氨基酸；引入芳香族氨基酸和疏水性氨基酸；在C端引入二硫鍵，設(shè)計雜合酶基因，對雜合酶基因序列分析，基因全合成，在畢赤酵母中表達(dá)雜合酶基因，測定酶學(xué)性質(zhì)，探討酶構(gòu)效關(guān)系。選育高產(chǎn)菌株，并對其發(fā)酵工藝進行初步研究，有望為木聚糖酶分子改造研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

菌株及質(zhì)粒：黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S、EscherichiacoliDH5α由作者所在實驗室保存；PichiapastorisGS115、表達(dá)載體pPIC9K，Invitrogen公司。

主要試劑及工具酶：DNA質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒，Sangon公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker及T4DNA Ligase等,TaKaRa公司。

主要培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%土豆浸汁(豆芽浸汁、麩皮浸汁)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%蛋白胨、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%硫酸銨、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% 100 μmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000梯度PCR擴增儀，美國Bio-Rad公司;DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠;DC-0506fE溫恒槽，上海比朗儀器有限公司;HZQ-F160A恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Neofuge 23R高速冷凍離心機，上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 引物

根據(jù)Xyn-ZL基因序列結(jié)合pPIC9K多克隆位點，設(shè)計引物ZL-JF：CCGGAATTCATGGCTCAGACCTGTTTGAC(EcoRI)，ZL-JR：ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGAACACAGATGGAC(NotI)。

1.4 驗證方法

1.4.1 木聚糖酶基因生物信息學(xué)分析

GenBank中通過BLAST查詢相似序列，序列的同源性比較及核苷酸序列分析利用DNAMAN 5.0軟件處理，并將翻譯后氨基酸序列進行Chou-Fasman二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與swissmodel三維結(jié)構(gòu)的同源建模。利用DiANNA預(yù)測分子內(nèi)二硫鍵，確定突變位點,以及利用http://www.uniprot.org/uniprot/P82973預(yù)測木聚糖酶活性中心。N-糖基化分析用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)，O-糖基化分析用NetOGlyc 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)。

1.4.2 雜合酶基因序列設(shè)計及合成

將黑曲霉XZ-3S木聚糖酶XynZF-2的N端48個氨基酸替換成EvXyn11 N端的34個氨基酸；引入芳香族氨基酸P9Y和H14F；在C端引入二硫鍵Cys38-Cys191；α-螺旋及cord區(qū)域分別引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A。將該雜合酶序列送于公司進行全序列合成。

1.4.3 雜合酶基因工程菌構(gòu)建

用引物ZL-JF、ZL-JR PCR擴增雜合酶基因，PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物和酵母表達(dá)載體pPIC9K經(jīng)EcoRI、NotI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后經(jīng)T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，在含有抗性平板上篩選陽性重組克隆子pPIC9K-ZL，提取質(zhì)粒，進行雙酶切驗證。將重組質(zhì)粒線性化，電轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115，篩選得到His+克隆，保存轉(zhuǎn)化子，經(jīng)G418(工作濃度為4.0 mg/mL)濃度篩選，獲得目的基因的高拷貝轉(zhuǎn)化子GS115-Xyn-ZL。

1.4.4 重組菌搖瓶發(fā)酵工藝研究

采用單因素實驗設(shè)計研究發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、種齡、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)起始pH、甲醇誘導(dǎo)濃度等對重組菌GS115-Xyn-ZL產(chǎn)酶的影響。

1.4.5 木聚糖酶活力的測定

采用DNS法測酶活力[16]。酶活力單位的定義：在40 ℃和pH 5.0條件下，以0.5%樺木木聚糖作為底物，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需的酶量為1個酶活力單位。以木糖作為標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.896 3x-0.025 6，R2=0.999 9。相對酶活力定義：以同組最高酶活力為100%計算各因素的相對酶活力。

1.4.6 蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)分析

發(fā)酵液經(jīng)離心、透析袋(14.0 kDa孔徑)透析、濃縮處理，取上清進行5%濃縮膠，12%分離膠的SDS-PAGE電泳。

1.4.7 重組酶酶學(xué)性質(zhì)測定

1.4.7.1 最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性

在pH 5.0，溫度分別為35、40、45、50、55和60 ℃條件下反應(yīng)15 min，按照木聚糖酶活力測定方法測定GS115-Xyn-ZL酶活力，以此來確定木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度。將GS115-Xyn-ZL酶液在45、50和55 ℃條件下分別保溫處理1 h，每隔5 min取樣1次，按常規(guī)方法進行殘余酶活力測定，以未保溫(4 ℃冰箱)的酶樣活力為100%，以此來確定酶的穩(wěn)定性。

1.4.7.2 最適pH及pH穩(wěn)定性

于最適反應(yīng)溫度下，測定GS115-Xyn-ZL發(fā)酵液分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的條件下的酶活力，以最高酶活力為100%，以此來確定酶的最適反應(yīng)pH。在40 ℃條件下，將酶液在不同pH下保溫1 h，再分別測定殘留酶活力與未處理酶的活力比，計算百分比，由此確定酶的pH穩(wěn)定性。

1.4.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

每個實驗重復(fù)3次，取其均值，經(jīng)Excel辦公軟件和SPSS11.0軟件處理最終實驗數(shù)據(jù)結(jié)果，繪制相應(yīng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶基因生物信息學(xué)分析

雜合木聚糖酶XynZL同源建模(圖1)發(fā)現(xiàn)，突變酶與原酶結(jié)構(gòu)相似，都屬于GH11家族，由1個簡單的α-螺旋以及2個反向的β-折疊片層組成，呈右手半握狀結(jié)構(gòu)。預(yù)測活性中心為Glu89、Glu180。此外雜合酶XynZL相較原酶XynZF-2基因改變的氨基酸位點均在圖1中標(biāo)識。

圖1 雜合木聚糖酶XynZL三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖譜Fig.1 Three-dimensional structure of heterozygous xylanase XynZL

2.2 雜合酶基因序列設(shè)計及合成

雜合酶序列送于公司進行全序列合成,得到雜合酶基因及雜合酶序列圖譜(圖2)，GenBank登錄號為MK484115。

圖2 人工酶序列圖譜Fig.2 Sequence of artificial enzyme注：單下劃線為替換成EvXyn11 N端的34個氨基酸，陰影為引入的芳香族氨基酸P9Y和H14F,斜體為C端引入的二硫鍵Cys38-Cys191;雙下劃線表示α-螺旋及cord區(qū)域分布引入的疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A。

2.3 雜合酶基因工程菌構(gòu)建

PCR擴增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳如圖3所示。

M-DL1000 DNA Marker；1-PCR產(chǎn)物圖3 目的基因PCR擴增Fig.3 PCR amplification of xylanase gene

篩選陽性重組克隆子，提取質(zhì)粒，雙酶切瓊脂糖凝膠電泳顯示目的基因與載體成功連接(圖4)。重組質(zhì)粒線性化，電轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115，篩選得到His+克隆，保存轉(zhuǎn)化子，經(jīng)G418濃度篩選，獲得目的基因的高拷貝轉(zhuǎn)化子。

1-重組質(zhì)粒雙酶切；M-DL1000 DNA Marker；M’-1Kb DNA Marker圖4 重組質(zhì)粒雙酶切驗證Fig.4 Enzyme digestion of recombinant plasmid

2.4 重組菌搖瓶發(fā)酵工藝研究

對重組菌GS115-Xyn-ZL進行搖瓶表達(dá)，采用單因素手段確定搖瓶發(fā)酵的最適條件。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基(圖5-a)；最佳誘導(dǎo)溫度：28 ℃(圖5-b)；最佳種齡(OD600為13.182)：20 h(圖5-c)；最佳誘導(dǎo)時間：168 h(圖5-d)；最佳誘導(dǎo)起始pH：pH 6.5(圖5-e)；甲醇誘導(dǎo)最佳濃度：體積分?jǐn)?shù)1.5%(15 mL/L)(圖5-f)。

2.5 蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)分析

由圖6可見，目的菌株GS115-XynZL在泳道中有明顯條帶，分子量約為24.60 kDa，對照組在對應(yīng)位置沒有條帶，證明重組菌成功表達(dá)了目的蛋白。

圖5 單因素優(yōu)化發(fā)酵最適條件Fig.5 Optimum fermentation conditions by single factor

1-GS115-XynZL蛋白條帶；2-GS115/pPIC9K蛋白條帶圖6 重組木聚糖酶SDS-PAGE電泳分析Fig.6 SDS-PAGE electrophoretic analysis of recombinant xylanase

2.6 重組酶酶學(xué)性質(zhì)測定

從圖7-a可見，該重組酶最佳反應(yīng)溫度為50 ℃，比XynZF-2最適反應(yīng)溫度[17]提高10 ℃。在50 ℃保溫30 min，相對殘余酶活力為58.2%(圖7-b)，比XynZF-2(9.2%)[17]有顯著提升。最適pH為pH 5.0(圖7-c)，與XynZF-2[17]基本一致。從圖7-d可見，該重組酶在pH 5.0～9.0保持較高的活力，相比XynZF-2，pH穩(wěn)定范圍有所拓寬。

3 結(jié)論與討論

目前，改良木聚糖酶分子主要通過理性設(shè)計、非理性設(shè)計及介于兩者之間的半理性設(shè)計來實現(xiàn)，以獲得酶學(xué)特性優(yōu)良的木聚糖酶[18-19]。大量研究使得人們對木聚糖酶分子結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性有了一定程度的了解。侯潔等[20-21]通過在N端引入部分氨基酸以及構(gòu)建二硫鍵，可以將變性溫度顯著提升且仍保持較高的酶活力，由此可知，N端改造可以對GH11 家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性起到良好的改善作用。李婧逸等[22-23]通過定點突變T205C和A52C在C端引入二硫鍵，發(fā)現(xiàn)突變酶XynZF T205C-A52C的最適溫度比原酶XynZF-2提高10 ℃以及其在50 ℃的熱穩(wěn)定性進一步提高，引入二硫鍵能提高黑曲霉木聚糖酶熱穩(wěn)定性。以大量研究為基礎(chǔ)，本實驗將多個影響酶熱穩(wěn)定性的因素融合，以期為木聚糖酶分子改造提供新的思路。

圖7 重組酶酶學(xué)性質(zhì)Fig.7 Enzymatic properties of recombinant xylanase

選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)是蛋白質(zhì)體外成功表達(dá)的關(guān)鍵，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，屬于酵母表達(dá)系統(tǒng)的一種。酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。酵母表達(dá)系統(tǒng)由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點，應(yīng)用此系統(tǒng)可高水平表達(dá)蛋白，且具有翻譯后修飾功能，外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，所以酵母表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是一種表達(dá)大規(guī)模蛋白的強有力的工具。