王賀，曹文紅,2,3,4*，章超樺,2,3,4，秦小明,2,3,4，鄭惠娜,2,3,4，高加龍,2,3,4

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)2(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088)3(廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524088)4(水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088)

在對(duì)蝦加工過(guò)程中，產(chǎn)生約占機(jī)體總質(zhì)量30%～40%的蝦頭副產(chǎn)物[1]。對(duì)蝦的生理結(jié)構(gòu)獨(dú)特，頭部分布消化道、消化腺等消化系統(tǒng)，含有豐富的內(nèi)源酶[2]。前期研究表明，UV-C輻照可提高蝦頭內(nèi)源蛋白酶酶活，但對(duì)不同種類內(nèi)源酶的作用尚不清楚[3]。UV-C波段波長(zhǎng)為190～280 nm，有強(qiáng)烈的殺菌作用，可使蛋白質(zhì)和DNA變性。UV-C輻照是一種應(yīng)用廣泛的食品保鮮技術(shù)[4],可引起酶蛋白的變性，易導(dǎo)致蛋白酶失活。但一些研究顯示，適度劑量的UV-C會(huì)對(duì)生物酶具有激活作用。用UV-C輻照南極黃絲瓜蘚，其過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶和過(guò)氧化物酶的酶活性均顯著升高[5]，經(jīng)UV-C輻照后的銀杏葉的抗氧化活性顯著提高[6]。課題組開發(fā)了基于UV-C輻照和梯度溫度實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)高效回收的蝦頭快速自溶技術(shù)[7-8]，以凡納濱對(duì)蝦蝦頭為研究對(duì)象，檢測(cè)分析UV-C輻照對(duì)蝦頭主要內(nèi)源酶酶學(xué)性質(zhì)及酶活的影響規(guī)律，為UV-C輻照激活蝦頭內(nèi)源酶的機(jī)制研究及蝦頭酶制劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦頭：鮮活凡納濱對(duì)蝦，購(gòu)于湛江市湖光鎮(zhèn)市場(chǎng)，活體摘取蝦頭；福林酚試劑，北京鼎國(guó)生物科技有限公司；Chitin和牛血紅蛋白，Sigma公司；蝸牛酶、棕櫚酸對(duì)硝基苯酯、L-酪氨酸和甘氨酸，上海源葉生物有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

HH-4A型數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司；PHSJ-4F型精密pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-2550UV-C可見分光光度計(jì),上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司；T-18型分散機(jī),上海珂淮儀器有限公司；TGL 16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；30 W紫外燈(波長(zhǎng)253.7 nm),廣東雪萊特光電科股份有限公司；Varioskan Flash型全自動(dòng)酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蝦頭UV-C輻照的方法

UV-C輻照蝦頭促進(jìn)內(nèi)源酶活力參考CAO[7]等的方法。取蝦頭勻漿，平鋪于托盤上(蝦漿厚度小于5 mm)，置于紫外燈下輻照以激活內(nèi)源酶(UV-C輻照條件：紫外燈功率30 W，紫外燈高于托盤20 cm，輻照時(shí)間20 min)。溫度和pH對(duì)內(nèi)源酶酶活影響較大，故以UV-C輻照、溫度和pH為條件測(cè)定酶活，探究其對(duì)內(nèi)源酶的影響。

1.3.2 蝦頭內(nèi)源酶液初步提取

內(nèi)源酸性蛋白酶酶液提?。簩⑽r頭在低溫條件下勻漿，按體積比1∶3加入預(yù)冷(4 ℃)0.05 mol/L pH 3的甘氨酸-HCl緩沖液均質(zhì)，在高速冷凍離心機(jī)以4 ℃、9 000 r/min離心10 min，上清液即為初步提取酶液。

內(nèi)源堿性蛋白酶酶液提?。簩⑽r頭在低溫條件下勻漿，按體積比1∶3加入預(yù)冷(4 ℃)0.05 mol/L pH 8的磷酸鹽緩沖液均質(zhì)，在高速冷凍離心機(jī)以4 ℃、9 000 r/min離心10 min，上清液即為初步提取酶液[9]。

內(nèi)源脂肪酶酶液提?。喊次r頭和緩沖液體積比1∶2加入預(yù)冷(4 ℃)的 0.05 mol/L pH 8的Tris-HCl緩沖液，均質(zhì)，在高速冷凍離心機(jī)以10 000 r/min、4 ℃離心25 min，重復(fù)2次，取上清液，即為粗酶液[10-12]。

內(nèi)源幾丁質(zhì)酶酶液提?。簩⑽r頭按體積比1∶4加入20 mmol/L pH 5的醋酸鈉緩沖液，在組織搗碎機(jī)中勻漿后速凍至0 ℃。解凍后在4 ℃抽提1 h，以8 000 r/min離心15 min，取上清液[13]。

內(nèi)源多酚氧化酶酶液提取：蝦頭在低溫條件下勻漿，加入2.5倍體積的0.067 mol/L磷酸緩沖液(0 ℃，pH 7.2)進(jìn)行勻漿，勻漿后在4 ℃、10 000 r/min下離心30 min，合并上清液即為粗酶提取液[14-16]。

1.3.3 內(nèi)源酶酶活力檢測(cè)

1.3.3.1 酸性蛋白酶酶活力檢測(cè)

準(zhǔn)確配制所需pH的0.5%(體積分?jǐn)?shù))的血紅蛋白溶液。取3支試管分別加入經(jīng)稀釋后的酶液20 μL、血紅蛋白溶液1 mL，室溫(25 ℃)下反應(yīng)20 min，加入0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)0.5 mL終止反應(yīng)，常溫下以10 000 r/min離心20 min，在280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。

1.3.3.2 堿性蛋白酶活力檢測(cè)

準(zhǔn)確配制所需pH的2%(體積分?jǐn)?shù))的酪蛋白溶液。將1 mL 2%酪蛋白溶液于相應(yīng)溫度下預(yù)熱5 min，然后加入1 mL經(jīng)稀釋后的粗酶液于相應(yīng)最適溫度下保溫20 min，加入2 mL 0.4 mol/L TCA終止反應(yīng)，繼續(xù)保溫10 min使殘余蛋白質(zhì)沉淀完全，然后于常溫下以10 000 r/min離心15 min，取1mL上清液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，空白溶液的配制：將1 mL酶液保溫5 min，加入2 mL TCA，然后加入1 mL 2%酪蛋白溶液，靜置10 min，于常溫下以10 000 r/min離心15 min，上清液即為空白溶液。取上清液1 mL于500 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。

1.3.3.3 脂肪酶酶活力檢測(cè)

取4-硝基苯磷酸二鈉(pNPP)底物溶液，加入1 mL 0.05 moL/L pH 8的Tris-HCl溶液，混合均勻，37 ℃穩(wěn)定2 min。在平行樣中加入300 μL酶液，37 ℃水浴反應(yīng)15 min。在空白管內(nèi)加入300 μL已經(jīng)滅活的酶，并將所有的管放入-20 ℃保持5 min以終止反應(yīng)。在410 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.3.3.4 幾丁質(zhì)酶酶活力檢測(cè)

取3支試管，分別加入0.05 mol/L醋酸緩沖液、1%(體積分?jǐn)?shù))膠體幾丁質(zhì)、粗酶液各50 μL，37 ℃水浴反應(yīng)2 h，4 000 r/min離心10 min終止反應(yīng)。取上述反應(yīng)的上清液50 μL，加入5 μL 1%(體積分?jǐn)?shù))蝸牛酶溶液，在37 ℃水浴反應(yīng)30 min；隨后加入25 μL飽和硼砂溶液，沸水浴7 min；待冷卻后，向試管內(nèi)加入250 μL冰醋酸、125 μL 1%(體積分?jǐn)?shù))對(duì)二氨基苯甲醛(DMAB)溶液，并在37 ℃水浴中反應(yīng)15 min；在585 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.3.3.5 多酚氧化酶酶活力檢測(cè)

準(zhǔn)確配制0.5 moL/L兒茶酚溶液、0.5 moL/LL-脯氨酸溶液和0.067 moL/L磷酸鹽溶液，取3支試管，先后加入2.2 mL磷酸緩沖液、0.2 mLL-脯氨酸、0.2 mL兒茶酚，以及0.4 mL酶液，將試管置于37 ℃恒溫水浴中10 min；然后將反應(yīng)溶液置于比色皿中，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.4 UV-C輻照前后pH和溫度對(duì)內(nèi)源酶酶活力的影響

取新鮮蝦頭勻漿，探究UV-C輻照前后pH對(duì)內(nèi)源酶的影響，經(jīng)過(guò)UV-C輻照后，蛋白酶在40 ℃分別取pH 2～10測(cè)定酶活力。脂肪酶在40 ℃分別取pH 6～11測(cè)定酶活力。幾丁質(zhì)酶在37 ℃分別取pH 3～9測(cè)定酶活力。多酚氧化酶在37 ℃分別取pH 6～10測(cè)定酶活力。不經(jīng)過(guò)UV-C輻照作為對(duì)照組，其余操作與上述相同。探究UV-C輻照前后溫度對(duì)內(nèi)源酶的影響，經(jīng)UV-C輻照后蛋白酶分別在最適pH 3和pH 8 于10～70 ℃下測(cè)定酶活力；脂肪酶在pH 10于20～70 ℃測(cè)定酶活力。幾丁質(zhì)酶在pH 5于20～60 ℃測(cè)定酶活力。多酚氧化酶在pH 6于25～75 ℃下測(cè)定酶活力。不經(jīng)過(guò)UV-C輻照作為對(duì)照組，其余操作與上述相同。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用Excel 2010進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差分析和作圖，UV-C輻照前后的酶活差異性采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為顯著差異(*)，P<0.01為極顯著差異(**)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH和溫度對(duì)UV-C輻照前后凡納濱對(duì)蝦蝦頭內(nèi)源蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

pH和溫度是影響蛋白酶酶活力的重要因素。UV-C輻照前后在pH 2～11之間蝦頭的蛋白酶活性如圖1所示。

圖1 pH對(duì)UV-C輻照前后蝦頭內(nèi)源蛋白酶酶活的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of the endogenous protease in shrimp head before and after UV-C irradiation注：**表示在P<0.05水平上具有顯著性差異；“表示在P<0.01水平上具有極顯著性差異。下同。

UV-C輻照前后蝦頭的內(nèi)源蛋白酶在酸性、堿性范圍內(nèi)均存在蛋白酶活性峰，其中酸性蛋白酶在pH 3～6左右，隨著pH值的升高，酶活力逐漸變?nèi)?，而UV-C輻照前后活性峰都在pH 3左右，和本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果研究相同[17]。說(shuō)明凡納濱對(duì)蝦酸性蛋白酶最適pH為3。堿性蛋白酶活性峰在pH 8～10之間，隨著pH值再升高，酶活力逐漸下降，且UV-C輻照前后最適pH無(wú)明顯變化，與莊志凱的研究結(jié)果相似[9]，比DADSHAHI等從凡納濱對(duì)蝦中提取出的一種新型熱穩(wěn)定性蛋白酶的最適pH值7略高[18]，可能與生活環(huán)境有關(guān)。如圖2所示，在pH 3、溫度60 ℃蝦頭內(nèi)源酸性蛋白酶經(jīng)UV-C輻照后酶活力(408.93 U/g)極顯著高于未經(jīng)過(guò)UV-C輻照的蝦頭內(nèi)源蛋白酶(329.81 U/g)(P<0.01)，提高了23.99%。在其他溫度下，UV-C輻照后蝦頭內(nèi)源蛋白酶的活力也均不同程度地高于未UV-C輻照的對(duì)照組；酸性蛋白酶的最適溫度為50～70 ℃左右，與沈文英所研究的最適溫度37 ℃相比略高[19]。圖3為不同溫度條件下UV-C輻照前后蝦頭內(nèi)源堿性蛋白酶的酶活力變化，結(jié)果顯示內(nèi)源堿性蛋白酶(pH 8)在30、40、60 ℃時(shí)酶活力顯著提高(P<0.05)，在40 ℃時(shí)由2 253.45 U/g上升為3 098.24 U/g，提高了37.49%，其最適溫度在40～60 ℃。研究發(fā)現(xiàn)海洋堿性蛋白酶最適溫度60 ℃[20]，潘濱等也研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦堿性蛋白酶最適溫度為40～60 ℃[21]，說(shuō)明堿性蛋白酶在此溫度范圍內(nèi)都有較高酶活。UV-C輻照能夠促進(jìn)蝦頭自溶[22]，且UV-C輻照前后不同溫度、pH下的酶活力變化數(shù)據(jù)表明，UV-C輻照能進(jìn)一步提高蝦頭中原有活性蛋白酶的酶活，但不能激活新的內(nèi)源蛋白酶。

圖2 溫度對(duì)UV-C輻照前后蝦頭內(nèi)源酸性蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of the endogenous acid protease in shrimp head before and after UV-C irradiation

圖3 溫度對(duì)UV-C輻照前后蝦頭內(nèi)源堿性蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of the endogenous alkaline protease in shrimp head before and after UV-C irradiation

2.2 pH和溫度對(duì)UV-C輻照前后凡納濱對(duì)蝦蝦頭內(nèi)源脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

在pH 6～11脂肪酶酶活力變化如圖4所示，脂肪酶的活性總體先增加后降低，在pH 6～11，40 ℃時(shí)UV-C輻照大部分極顯著高于對(duì)照組。其中pH 8酶活力由2.17 U/g上升為5.28 U/g提高了143.32%(P<0.01)。pH 10時(shí)酶活力由5.24 U/g上升為6.36 U/g，提高了21.37%(P<0.01)。脂肪酶酶活力最適pH為10左右，和南極磷蝦相似，但是最適溫度比南極磷蝦高[11]，可能是它們生活環(huán)境所致。經(jīng)UV-C輻照后，在pH為6～10時(shí)蝦頭均顯示出較高的脂肪酶活性，且最適pH范圍擴(kuò)大。由圖5所知，不同溫度下的酶活力先升高后降低，表明脂肪酶活化分子在一定范圍內(nèi)隨著溫度的增加而增加，從而使催化反應(yīng)加快，但是脂肪酶處于高溫情況下容易變性失活進(jìn)而導(dǎo)致酶活力降低。在溫度為40 ℃左右時(shí)酶反應(yīng)速率最高；50 ℃以后，酶活力下降。在溫度為70 ℃時(shí)酶失活，與其他學(xué)者研究結(jié)果相似[23]。經(jīng)UV-C輻照后，在20、40和50 ℃酶活力極顯著提高(P<0.01)。其中20 ℃時(shí)，酶活力由1.36 U/g上升為2.11 U/g，提高了55.15%。50 ℃時(shí)酶活力由0.85 U/g上升為1.69 U/g，提高了98.82%。UV-C輻照對(duì)蝦頭內(nèi)源脂肪酶的最適pH范圍有所擴(kuò)大，但最適溫度無(wú)顯著變化。

圖4 pH對(duì)UV-C輻照前后蝦頭內(nèi)源脂肪酶酶活的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of the endogenous lipase in shrimp head before and after UV-C irradiation

圖5 溫度對(duì)UV-C輻照前后蝦頭內(nèi)源脂肪酶酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of the endogenous lipase in shrimp head before and after UV-C irradiation

2.3 pH和溫度對(duì)UV-C輻照前后凡納濱對(duì)蝦蝦頭內(nèi)源幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

幾丁質(zhì)代謝與蝦的生長(zhǎng)密切相關(guān)，它在蝦殼中合成、裂解[24]、體液調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用[25]。蝦頭中含有幾丁質(zhì)酶并且肝胰腺中酶活力較高[26]。由圖6所知，UV-C輻照前幾丁質(zhì)酶最適pH為5左右，與脊尾白蝦中最適pH值相似[13]，日本囊對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶最適pH 6.7[27]。經(jīng)UV-C輻照后最適pH變?yōu)?左右。在40 ℃、pH 6時(shí)UV-C輻照后幾丁質(zhì)酶酶活力由3.74 U/g上升為5.15 U/g，提高了37.70%，酶活力顯著提高(P<0.05)。由圖7所示，幾丁質(zhì)酶最適作用溫度為40 ℃，與羅氏沼蝦[28]和脊尾白蝦[13]的最適溫度類似。在pH 6、不同溫度下，經(jīng)UV-C輻照后酶活力都有極顯著差異，其中20 ℃時(shí)，UV-C輻照后酶活力由3.67 U/g上升為5.12 U/g，提高了39.51%(P<0.01)。30 ℃時(shí)，UV-C輻照后酶活力由3.76 U/g上升為4.89 U/g，提高了30.05%(P<0.01)。60 ℃時(shí)，UV-C輻照后酶活力由3.75 U/g上升為4.65 U/g，提高了24.00%(P<0.01)。因此，UV-C輻照對(duì)蝦頭幾丁質(zhì)酶具有顯著的激活作用，對(duì)其最適pH有所影響，對(duì)其最適溫度的影響不明顯。

圖6 pH對(duì)UV-C輻照前后蝦頭內(nèi)源幾丁質(zhì)酶酶活的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of the endogenous chitinase in shrimp head before and after UV-C irradiation

圖7 溫度對(duì)UV-C輻照前后蝦頭內(nèi)源幾丁質(zhì)酶酶活的影響Fig.7 Effect of temperature on the activity of the endogenous chitinase in shrimp head before and after UV-C irradiation

2.4 pH和溫度對(duì)UV-C輻照前后凡納濱對(duì)蝦蝦頭內(nèi)源多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

UV-C輻照前后凡納濱對(duì)蝦蝦頭內(nèi)源多酚氧化酶在不同pH條件下的酶活力變化如圖8所示，UV-C輻照前后多酚氧化酶酶活力在pH 6～10都存在一個(gè)活性峰，其最適pH為8，與東海中華管鞭蝦最適pH 7.5相近[29]；在經(jīng)過(guò)UV-C輻照后酶活力均顯著提高，在pH為8時(shí)酶活力，由47.29 U/g提高到69.29 U/g，提升了46.52%(P<0.01)。圖9為pH 8時(shí)不同溫度對(duì)蝦頭內(nèi)源多酚氧化酶活力的影響，在25～75 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高多酚氧化酶酶活力呈下降趨勢(shì)，但在75 ℃尚未完全失活，與CARVALHO等人的研究結(jié)果相似[30]。在溫度為35 ℃時(shí)，經(jīng)UV-C輻照后酶活由42.44 U/g上升為54.54 U/g，提高了28.51%(P<0.01)。在45 ℃時(shí)，經(jīng)UV-C輻照后酶活由30.10 U/g上升為34.74 U/g，提高了15.42%(P<0.05)。在55 ℃時(shí)，經(jīng)UV-C輻照后酶活力由26.92 U/g上升為29.55 U/g，提高了9.77%(P<0.05)。結(jié)果表明UV-C輻照對(duì)多酚氧化酶最適pH和溫度沒(méi)有明顯影響，對(duì)酶活力有顯著激活作用。

圖8 pH對(duì)UV-C輻照前后多酚氧化酶酶活影響Fig.8 Effect of pH on the activity of the endogenous polyphenol oxidase in shrimp head before and after UV-C irradiation

圖9 溫度對(duì)UV-C輻照前后多酚氧化酶酶活影響Fig.9 Effect of temperature on the activity of the endogenous polyphenol oxidase in shrimp head before and after UV-C irradiation

3 結(jié)論

(1)UV-C輻照前后蝦頭酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和多酚氧化酶的最適pH和溫度的酶學(xué)特性無(wú)明顯變化，對(duì)脂肪酶和幾丁質(zhì)酶的最適pH有所改變，對(duì)各種內(nèi)源酶的最適溫度均無(wú)顯著影響。UV-C輻照后，內(nèi)源酸性蛋白酶最適為pH 3，溫度60 ℃左右；內(nèi)源堿性蛋白酶的最適pH 8，溫度50 ℃左右；內(nèi)源幾丁質(zhì)酶最適pH由5變?yōu)?左右，溫度40 ℃左右；內(nèi)源脂肪酶最適pH由10變?yōu)?～10，溫度40 ℃左右；內(nèi)源多酚氧化酶最適pH 8，溫度為25 ℃左右。

(2)在30 W、20 cm高度、UV-C輻照20 min的最適條件下，UV-C輻照后內(nèi)源酶酶活提高，酸性蛋白酶酶活由329.81 U/g上升為408.93 U/g，提高了23.99%；堿性蛋白酶由2 253.45 U/g上升為3 098.24 U/g，提高了37.49%；脂肪酶由5.24 U/g上升為6.36 U/g，提高了21.37%；幾丁質(zhì)酶由3.74 U/g上升為5.15 U/g，提高了37.70%；多酚氧化酶由47.29 U/g上升為69.29 U/g，提高了46.52%。

(3)UV-C輻照對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦頭主要內(nèi)源酶均有顯著的激活作用，但其激活機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。