葉文琪，薛嵐，王超，崔文璟，周哲敏，劉中美

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

β-丙氨酸(3-氨基丙酸)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域，目前主要是以丙烯腈或β-氨基丙腈為底物通過(guò)化學(xué)合成[1-2]。隨著環(huán)境問(wèn)題日益引起人們的關(guān)注，傳統(tǒng)的化學(xué)方法將逐漸被生物方法所取代，如酶轉(zhuǎn)化法、全細(xì)胞催化法和發(fā)酵法[3-4]。

L-天冬氨酸-α-脫羧酶(EC4.1.1.11 ADC)是催化L-天冬氨酸產(chǎn)生β-丙氨酸的關(guān)鍵酶，近幾十年來(lái)受到廣泛的關(guān)注。細(xì)菌來(lái)源的ADC研究較多，包括來(lái)源于大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌和枯草芽孢桿菌的ADC等[5-8]。1979年，WILLIAMSON和BROWN首次從大腸桿菌中分離出ADC[9]，隨后RAMJEE等[10]對(duì)該酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征，其Km和kcat分別被確定為0.151 mm和0.57 s-1。谷氨酸棒桿菌來(lái)源的ADC比酶活為2.7 μmol/(min·mg)[11]。結(jié)核分枝桿菌來(lái)源的ADC經(jīng)過(guò)量表達(dá)、純化后，測(cè)得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和kcal分別為0.219 mm和0.65 s-1。，比酶活為2.1 μmol/(min·mg)[12]。

谷氨酸棒桿菌來(lái)源的ADC穩(wěn)定性好、酶活較高，具有工業(yè)應(yīng)用潛力。用谷氨酸棒桿菌來(lái)源的ADC純酶合成β-丙氨酸，產(chǎn)量可達(dá)到12.85 g/L[13]；過(guò)表達(dá)谷氨酸棒桿菌來(lái)源的ADC并設(shè)計(jì)代謝途徑，β-丙氨酸合成量達(dá)到32.3 g/L[14]；去年，LI等[15]構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)谷氨酸棒桿菌ADC的大腸桿菌重組菌，實(shí)施全細(xì)胞催化生產(chǎn)β-丙氨酸，產(chǎn)量達(dá)到24.8 g/L。

眾多的研究表明，微生物來(lái)源ADC的酶活力很低，使得β-丙氨酸的生物合成法受到限制。有研究表明，昆蟲(chóng)來(lái)源ADC的酶活力遠(yuǎn)高于細(xì)菌來(lái)源ADC[16-18]。在前期研究中，將紅粉甲蟲(chóng)(又名赤擬谷盜，Triboliumcastaneum)來(lái)源的ADC在大腸桿菌中重組表達(dá)，重組酶的比酶活是細(xì)菌來(lái)源的2倍左右[19]。對(duì)其進(jìn)行分子改造，初篩結(jié)果顯示突變體K49R穩(wěn)定性與酶活力較野生型有一定的優(yōu)勢(shì)[20]。本研究旨在實(shí)現(xiàn)β-丙氨酸“綠色生產(chǎn)”，篩選催化能力優(yōu)良的突變體、并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征，建立全細(xì)胞催化策略，優(yōu)化重組菌株合成β-丙氨酸的催化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

重組表達(dá)載體pEt-28a(+)-TcADC、pEt-28a(+)-TcADC/K49R為本實(shí)驗(yàn)室早期構(gòu)建，宿主菌E.coliBL21(DE3)為實(shí)驗(yàn)室保藏。種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2YT培養(yǎng)基。L-天冬氨酸鈉、β-丙氨酸、IPTG、卡那霉素購(gòu)于上海生工生物工程有限公司;酵母提取物、蛋白胨購(gòu)于Oxford公司；異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)購(gòu)于Sigma公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

蛋白純化儀和純化柱，GE Healthcare UK Ltd。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酶的過(guò)量表達(dá)與純化

將重組大腸桿菌BL21/pET28a-TcADC、BL21/pET28a-TcADC/K49R的單克隆接種于5 mL LB培養(yǎng)基(含有50 μg/mL卡那霉素)中，置于37 ℃、200 r/min的搖床中，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌種活化。按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于含有50 μg/mL卡那霉素的 2YT培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，在20℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)20 h左右。

利用Purifier AKTA蛋白純化儀和His Trap HP純化柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，收集沉淀。用Binding緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)懸浮細(xì)胞，置于冰上進(jìn)行超聲波破碎。溶液澄清之后，于4 ℃、12 000 r/min離心45 min，收集細(xì)胞破碎上清液。用Binding緩沖液，將0.45 μm濾膜過(guò)濾后的粗酶液上樣，用Binding緩沖液洗去非結(jié)合蛋白。用15個(gè)柱體積的Elution緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑)進(jìn)行線性洗脫，收集洗脫峰。放入50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)緩沖液中，4 ℃，過(guò)夜透析除去咪唑。利用12%(質(zhì)量濃度)的SDS-PAGE對(duì)分離純化樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用Brandford法測(cè)定目的蛋白濃度。

2.2 L-天冬氨酸和β-丙氨酸檢測(cè)

L-天冬氨酸和β-丙氨酸采用異硫氰酸苯酯(PITC)衍生法檢測(cè)[19-20]。氨基酸的衍生產(chǎn)物采用HPLC測(cè)定，色譜柱為L(zhǎng)a Chrom C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相A溶液80%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液，B溶液97∶3(體積分?jǐn)?shù)，pH 6.5)的0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈溶液；梯度洗脫：0～20 min，B溶液由95%下降至65%；20～30 min，B溶液由65%上升至95%；30～43 min，B溶液梯度保持不變，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為40 ℃。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

最適溫度測(cè)定。將pH 6.5的反應(yīng)液(含200 μg/mL純酶液，100 mmol/LL-天冬氨酸鈉，1 mmol/L PLP)置于不同溫度的水浴(30、37、40、42、50、55 ℃)中反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活。將最高酶活定義為100%，分析酶的最適反應(yīng)溫度。

溫度穩(wěn)定性測(cè)定。將500 μg/mL純酶液置于不同溫度(30、37、40、42、50、55 ℃)孵育30 min后，于冰上冷卻5 min。加入終濃度100 mmol/LL-天冬氨酸鈉和1 mmol/L PLP，于37 ℃，pH 6.5條件下反應(yīng)10 min測(cè)定殘余酶活。將初始酶活定義為100%，分析溫度穩(wěn)定性情況。

最適pH測(cè)定。配置不同pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0的反應(yīng)液(含200 μg/mL純酶液，100 mmol/LL-天冬氨酸鈉，1mmol/L PLP)，于37 ℃反應(yīng)10 min測(cè)定酶活性。將最高酶活定義為100%，分析酶的最適反應(yīng)pH。

pH穩(wěn)定性測(cè)定。將500 μg/mL純酶液置于不同pH緩沖液(pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0)中，于冰上過(guò)夜孵育。加入終濃度100 mmol/LL-天冬氨酸鈉和1 mmol/L PLP，于37 ℃，pH 6.5條件下反應(yīng)10 min測(cè)定殘余酶活。將初始酶活定義為100%，分析pH穩(wěn)定性情況。

動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定。在終濃度50 μg/mL純酶液中，分別加入終濃度5～100 mmol/LL-天冬氨酸鈉、終濃度1 mmol/L PLP，于37 ℃，pH 6.5條件下，反應(yīng)10 min檢測(cè)β-丙氨酸產(chǎn)量，測(cè)定初始反應(yīng)速率。采用GraphPad Prism軟件擬合曲線，測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km，kcat。

將在37 ℃，pH 6.5的條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸鈉生成1 mmolβ-丙氨酸所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。

2.4 全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸的體系優(yōu)化

以提高重組菌株的蛋白表達(dá)量及生物量為目的，在培養(yǎng)基中添加10和20 g/L葡萄糖，重組菌株經(jīng)0.2 mmol/L IPTG，20 ℃誘導(dǎo)20 h后，冰浴破碎，利用質(zhì)量濃度為12%的SDS-PAGE對(duì)重組酶的表達(dá)情況進(jìn)行電泳檢測(cè)。

重組菌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)后，離心收集，濃縮到OD600=200。在10 mL反應(yīng)液(pH 6.5)中，加入L-天冬氨酸鈉固體粉末至終濃度1 mol/L，1 mmol/L PLP，反應(yīng)溫度為37 ℃，持續(xù)攪拌。每隔2 h取樣測(cè)定L-天冬氨酸剩余量和β-丙氨酸的生成量。同時(shí)將不添加PLP的實(shí)驗(yàn)樣品作為對(duì)照組。

3 結(jié)果

3.1 L-天冬氨酸-α-脫羧酶的表達(dá)與純化

酶活與熱穩(wěn)定性初步篩選結(jié)果顯示，紅粉甲蟲(chóng)來(lái)源L-天冬氨酸-α-脫羧酶(TcADC)突變體K49R催化性能優(yōu)良。本研究將其過(guò)量表達(dá)并分離純化。分離純化結(jié)果如圖1所示，重組菌成功表達(dá)了野生型與突變體L-天冬氨酸-β-脫羧酶，且獲得了電泳純目的蛋白，分子量約為61 kDa。

圖1 重組酶過(guò)量表達(dá)與純化Fig.1 Overexpression and purification of recombinant enzymes

3.2 突變體K49R的酶學(xué)性質(zhì)表征

由圖2-a可知，野生型的最適溫度為37 ℃，突變體K49R的最適溫度為42 ℃。在不同溫度下處理酶30 min后測(cè)量其熱穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，野生型的酶活性降低，特別是在高于40 ℃時(shí)(圖2-b)。在40 ℃處理后，野生型的活性保持在70%，而在50 ℃處理情況下，野生型僅剩余22%的酶活；而突變體K49R穩(wěn)定性有所提高，50 ℃處理后仍剩余34%的酶活(圖2-b)。

野生型與突變體K49R的最適pH均為6.5(圖2-c)。在冰上在各種pH條件下孵育8 h后檢測(cè)其pH穩(wěn)定性，突變體K49R與野生型幾乎無(wú)差異：在pH 6.0～7.0之間保持穩(wěn)定，在pH低于5.5或高于7.5時(shí)，TcADC的剩余酶活低于75%(圖2-d)。

a-最適溫度;b-溫度穩(wěn)定性;c-最適pH;d-pH穩(wěn)定性圖2 溫度與pH對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effects of temperature and pH on enzymatic activity

測(cè)定突變體K49R的比活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表1)并與野生型進(jìn)行比較。野生型的比活性為290±9.5 U/g，Km為5.63±0.36 mmol/L，kcat為16.9±0.6 s-1。突變體K49R的Km值有大幅下降，表明其底物親和力優(yōu)于野生型；雖然kcat值略有下降，但是催化效率還是有顯著提升，是野生型的1.8倍。

表1 動(dòng)力學(xué)參數(shù)與比酶活Table 1 Kinetic parameters and specific activities

3.3 全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸

3.3.1 重組ADC表達(dá)條件的優(yōu)化

以提高重組菌株的蛋白表達(dá)量及生物量為目的，在培養(yǎng)基中添加葡萄糖。培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)后，蛋白表達(dá)情況如圖3所示。添加10 g/L葡萄糖后，蛋白表達(dá)量有所增加，可溶性與沉淀中的蛋白量都隨之增加。與添加20 g/L葡萄糖和未添加葡萄糖相比，添加量為10 g/L時(shí)，相同生物量的菌體內(nèi)可溶性蛋白含量較高。另外，添加葡萄糖后，其生物量也從OD6005.8提高到8.8。

圖3 葡萄糖對(duì)重組ADC的影響Fig.3 Effect of glucose on the expression of TcADC

3.3.2 PLP對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

TcADC為PLP依賴型酶，通過(guò)一次性加入高濃度底物的方法研究PLP對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響。在含有重組大腸桿菌細(xì)胞(OD600=200)的反應(yīng)液中，添加1 mol/L的L-天冬氨酸進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，定時(shí)取樣監(jiān)測(cè)的底物與產(chǎn)物的含量。結(jié)果如圖3所示，添加1 mmol/L PLP的反應(yīng)體系較快地完成了催化(圖4-b)，而未添加PLP的反應(yīng)體系也能完成催化，但是生產(chǎn)效率較低(圖4-a)。重組菌細(xì)胞內(nèi)的PLP作為輔酶參與全細(xì)胞催化，而額外添加PLP可以大幅提高β-丙氨酸生產(chǎn)效率。添加2 mmol/L的PLP或每隔10 h添加1 mmol/L的PLP，催化效率幾乎與添加1 mmol/L的PLP相同(數(shù)據(jù)未顯示)，表明在本全細(xì)胞催化體系中，一次性添加1 mmol/L的PLP可以滿足輔酶的供應(yīng)需求。

a-未添加PLP;b-添加1 mmol/L PLP圖4 PLP對(duì)全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸的影響Fig.4 Effect of PLP on β-alanine synthesis using whole-cell catalysis

4 結(jié)論

目前，由于ADC的催化能力有限，限制了工業(yè)上生物合成法生產(chǎn)β-丙氨酸。本研究對(duì)紅粉甲蟲(chóng)L-天冬氨酸-β-脫羧酶的突變體K49R進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)解析，發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性較野生型有所提高，最適pH和pH穩(wěn)定性與野生型相差無(wú)幾。酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果顯示其催化效率是野生型的1.8倍，推測(cè)是得益于其大幅提高底物親和力。突變體K49R具有更優(yōu)良的催化性能以及很大的工業(yè)應(yīng)用潛力。全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸體系優(yōu)化結(jié)果顯示，添加10 g/L葡萄糖可以將重組菌生物量提高0.5倍，重組酶的表達(dá)量也相應(yīng)提升；添加適量PLP可以大幅縮短催化時(shí)間，提高β-丙氨酸的合成效率。