朱俊平，潘柳婷

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊 261061）

近幾年，我國鴨養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，但仍以“小規(guī)模、大群體”的養(yǎng)殖模式為主，使得鴨病流行較為廣泛[1]。鴨病毒性肝炎（DVH）主要引起20 日齡內(nèi)雛鴨的嚴重死亡，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。目前主要采取對種鴨或1 日齡雛鴨免疫疫苗的方式來預防DVH[2]。但許多地區(qū)采取主動或被動免疫后，仍無法有效控制該病的發(fā)生和流行，這可能與免疫程序是否有效有很大關(guān)系[3]。目前，對于疫苗免疫劑量和次數(shù)對鴨DVH 抗體影響的研究較少。本研究旨在了解免疫劑量和次數(shù)對楓葉鴨種鴨DVH 抗體產(chǎn)生的影響，以期為種鴨場免疫程序制定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗動物

2 月齡體質(zhì)量均等的楓葉種鴨120 只（試驗組），1 日齡體質(zhì)量均等的無母源抗體楓葉雛鴨120 只（對照組），均購自山東永惠楓葉種鴨有限公司，按照常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.2 試驗試劑

DVH 弱毒活疫苗（CH60 株），由哈藥集團生物疫苗有限公司生產(chǎn)；DVH 抗體（DVh-Ab）ELISA 檢測試劑盒，上海泛柯實業(yè)有限公司生產(chǎn)；鴨肝炎病毒AV2111 株，購自中國獸藥監(jiān)察所。

2 方法

2.1 試驗分組及免疫方案

將購買的120 只種鴨隨機分為3 組（A1、A2、A3），每組40 只。按照疫苗使用說明書稀釋疫苗。各組按不同免疫程序免疫DVH 弱毒苗，對免疫后收獲的第1 周及第4 周種蛋，按常規(guī)方法孵化。

A1 組：留種蛋前3 周，腿部肌內(nèi)注射DVH弱毒苗0.5 mL；A2 組：留種蛋前5 周和前3 周，各腿部肌內(nèi)注射DVH 弱毒苗0.5 mL；A3 組：留種蛋前5 周和前3 周，分別腿部肌內(nèi)注射DVH 弱毒苗0.5 mL 和1 mL。

2.2 雛鴨抗體水平檢測和攻毒保護試驗

2.2.1 第1 周種蛋孵化雛鴨（B 組）將A1、A2、A3 組種鴨免疫后收獲的第1 周種蛋孵出的雛鴨，對應編號B1、B2、B3 組，每組120 只；另設(shè)對照組，為購買的120 只1 日齡無母源抗體雛鴨。試驗組和對照組雛鴨分別在1、4、7、10 d 時心臟采血，采用ELISA 方法進行抗體檢測；同時于1、4、7、10 d 分別隨機取30 只，皮下注射0.1 mL 鴨肝炎病毒進行攻毒試驗，剩余雛鴨和對照組同期皮下注射生理鹽水0.1 mL。隔離常規(guī)飼養(yǎng)，觀察并記錄各組雛鴨發(fā)病死亡數(shù)量。

2.2.2 第4 周種蛋孵化雛鴨（C 組）將A1、A2、A3 組種鴨免疫后收獲的第4 周種蛋孵出的雛鴨，對應編號C1、C2、C3 組，每組120 只。試驗方法同B 組。

3 結(jié)果與分析

3.1 B 組試驗

種鴨接種DVH 疫苗后，分別檢測B1、B2、B3 組各日齡雛鴨的ELISA 抗體效價，計算平均值。結(jié)果顯示：B1 組平均抗體效價為0.52～0.57，雛鴨攻毒保護率為73.3%～93.3%；B2 組平均抗體效價為0.54～0.59，雛鴨攻毒保護率為86.7%～100%；B3 組平均抗體效價為0.56～0.63，雛鴨攻毒保護率為90.0%～100%。從結(jié)果中可以看出，各組的OD值1 日齡最高，之后隨日齡增長逐漸減少，雛鴨攻毒保護率也隨之降低（表1）。試驗過程中無其他情況導致的死亡。

表1 B 組雛鴨抗體水平測定和攻毒試驗結(jié)果

3.2 C 組試驗

種鴨接種DVH 疫苗后，分別檢測C1、C2、C3 組各日齡雛鴨的ELISA 抗體效價，計算平均值。結(jié)果顯示：C1 組平均抗體效價為0.40～0.46，雛鴨攻毒保護率為40.0%～56.7%；C2組平均抗體效價為0.42～0.47，雛鴨攻毒保護率為50.0%～60.0%；C3 組平均抗體效價為0.45～0.50，雛鴨攻毒保護率為56.7%～70.0%（表2）。試驗過程中無其他情況導致雛鴨死亡。從結(jié)果中能夠看出，隨日齡增長，C1、C2、C3 組雛鴨抗體效價均呈下降趨勢。

表2 C 組雛鴨抗體水平測定和攻毒試驗結(jié)果

3.3 數(shù)據(jù)對比

將兩組的檢測和試驗數(shù)據(jù)進行對比發(fā)現(xiàn)，OD值B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，說明鴨DVH弱毒苗（CH60 株）免疫劑量和免疫次數(shù)的確能夠影響鴨肝炎抗體水平。同時，攻毒保護試驗顯示，雛鴨保護率B3＞B2＞B1＞對照組，C3＞C2＞C1，與雛鴨抗體效價呈正相關(guān)，說明種鴨免疫后產(chǎn)生的母源抗體，能夠保護雛鴨不受鴨肝炎病毒侵害。C 組OD 值低于B 組，說明母源抗體會隨著種鴨免疫時間延長逐漸減少，從而降低對雛鴨的保護力。種鴨免疫后第4 周種蛋孵出雛鴨的攻毒保護率仍能夠達到50%以上，說明DVH 弱毒苗（CH60株）免疫效果確實有效。

4 討論

目前檢測DVH 抗體的方法主要有間接血凝抑制試驗、血清中和試驗、免疫擴散試驗、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗等。國標 GB/T 17999.5—1999 檢測DHV-Ⅰ及其抗體的方法為血清中和試驗[4]。雖然血清中和試驗是公認的權(quán)威性、高特異性方法，但其操作繁瑣、耗時。為此，研究人員開始建立其他檢測方法。如趙新柳等[5]首次建立了間接ELISA方法用于檢測鴨肝炎抗體，檢出陽性率為100%。近幾年很多學者不斷優(yōu)化間接 ELISA 試驗條件，使該法的敏感性和特異性逐步提高[6]。因此，本試驗選擇ELISA 檢測雛鴨母源抗體。本試驗檢測結(jié)果略高于孫泉云等[7]的間接ELISA 檢測結(jié)果，說明本研究所用疫苗效果較好。

由于DVH 病毒主要侵害20 日齡以內(nèi)，尤其是10 日齡內(nèi)的雛鴨，因此做好20 日齡以內(nèi)雛鴨的防疫工作非常重要。目前預防DVH 常用疫苗主要為滅活苗和弱毒苗。本試驗選用DVH 弱毒活疫苗（CH60 株），是因為該疫苗可以通過接種種鴨和雛鴨兩種方式進行DVH 防控。

有文獻[8]表示，若在雛鴨孵出后再對其免疫，則雛鴨在抗體產(chǎn)生過程中易感染DVH 病毒，因此應對種鴨進行免疫，將母源抗體通過卵傳遞給雛鴨，使雛鴨獲得保護。本試驗即通過對種鴨免疫，檢測雛鴨體內(nèi)的母源抗體效價，以此判斷母源抗體能否保護雛鴨不受DVH 病毒感染。攻毒保護試驗結(jié)果表明，有母源抗體的雛鴨組抗體效價明顯多于無母源抗體的雛鴨組，且攻毒后保護率較高，說明母源抗體能夠保護雛鴨不受DVH 病毒感染，且雛鴨體內(nèi)的抗體水平直接影響攻毒后對雛鴨的保護率。

攻毒試驗結(jié)果證明，間隔2 周再免疫同等劑量DVH 弱毒活疫苗（CH60）種鴨，比免疫1 次產(chǎn)生的抗體效價要高，說明免疫次數(shù)能夠影響產(chǎn)生鴨肝炎抗體水平。Rispensls[9]研究表明，種鴨免疫后第6 周進行2 次弱毒疫苗免疫，免疫后9 個月左右時間內(nèi)，其孵出的雛鴨能獲得較好的天然被動免疫。叢秋實[10]研究表明，在22 周進行初次免疫，24 周二次接種加強免疫，將會產(chǎn)生更為強的免疫效力。Hwang 等[11]也證實，為保證后代雛鴨有足夠高的抗體水平，對種鴨必須進行2 次或3 次弱毒苗免疫。本試驗結(jié)果也基本與上述研究結(jié)果相符。

即使僅免疫1 次，且免疫量為1 劑量/羽份，雛鴨攻毒保護率也能達到60%以上，說明DVH 弱毒苗（CH60 株）非常有效。

綜上所述，DVH 的免疫接種非常重要，能夠有效減少養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟損失，可以采用種鴨、雛鴨共同免疫的方法。但對雛鴨免疫，還需考慮免疫時雛鴨體內(nèi)是否有母源抗體的干擾。有文獻[12]表明，若母源抗體較高，則說明母源抗體還具有很好的保護性，雛鴨可在7～10 日齡免疫；若較低，則說明母源抗體已不能起到保護作用，應及時進行免疫，需要在1～3 日齡免疫。另外，國內(nèi)外不同學者所測不同疫苗達到較好免疫效果所用的免疫劑量和次數(shù)有所不同，這可能與疫苗種類有關(guān)。

因此，不同養(yǎng)鴨場在免疫前，應考慮不同疫苗間的免疫效果及相互作用，結(jié)合鴨肝炎母源抗體在雛鴨體內(nèi)的消長規(guī)律，測定本場雛鴨體內(nèi)抗體水平，最終制定出適合本場的DVH 免疫程序，這樣可最大程度減少DVH 引起的經(jīng)濟損失。

4 結(jié)論

研究表明：對種鴨進行DVH 疫苗免疫的次數(shù)和劑量，均能影響雛鴨體內(nèi)抗體水平的高低，進而影響對雛鴨的保護力；雛鴨母源抗體會隨著種鴨免疫時間延長逐漸減少，從而降低對雛鴨的保護力；對種鴨免疫DVH 弱毒苗（CH60 株）能夠?qū)Ψ醭龅碾r鴨提供較高的母源抗體。因此，為避免母源抗體干擾，建議對種鴨進行DVH 弱毒苗（CH60 株）免疫，為保證對雛鴨提供較強免疫的保護，最好對種鴨進行加強免疫。