王 婭，葉 鋒，劉麗婭，謝彩云，谷文喜，鐘 旗，易新萍，古麗扎提·塔力甫汗，馬曉菁

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830011）

萊姆?。↙yme disease，LD）是由硬蜱叮咬傳播的一種自然疫源性人獸共患疾病，其病原體為伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）。伯氏疏螺旋體是一種微嗜氧的革蘭氏陰性菌，生長緩慢，具有遺傳多態(tài)性。目前，已發(fā)現(xiàn)伯氏疏螺旋體約有20種基因型，其中5 種為致病基因型。我國主要存在3 種致病基因型[1-3]，分別是阿弗西尼疏螺旋體（B.afzefii）、伽氏疏螺旋體（B.garinii）以及狹義伯氏疏螺旋體（B.burdorferi sensu stricto）。萊姆病呈世界性分布，在全球70 多個國家均有病例報告，年發(fā)病約30 萬例，且有不斷增多的趨勢[4]。1982年以來，美國每年有近2 萬新發(fā)病例，是美國最常見的節(jié)肢動物傳染病。我國1986 年在黑龍江省海林縣首次發(fā)現(xiàn)萊姆病，至今在30 多個?。ㄖ陛犑小⒆灾螀^(qū)）均有報道，已從其中的19 個省（自治區(qū)、直轄市）采集的樣本中分離出病原體，證實(shí)我國存在萊姆病自然疫源地[5-7]。該病的發(fā)生和分布具有明顯的地區(qū)性，與當(dāng)?shù)仳绲姆N類、數(shù)量及其活動周期密切相關(guān)。我國萊姆病高發(fā)地區(qū)主要包括內(nèi)蒙古林區(qū)、西北林區(qū)和東北林區(qū)。生活在自然疫源地、有蜱活動林區(qū)的居民、工作者以及旅游者等，不論年齡、性別都可能感染萊姆病[8]。該病對人群的危害極大，不僅表現(xiàn)為皮膚損傷，也可造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及骨關(guān)節(jié)病，嚴(yán)重者終生殘疾，甚至死亡[9]。動物被攜帶病原體的蜱蟲叮咬后，可出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大、腦炎等一系列臨床癥狀。萊姆病不僅對公共安全造成威脅，同時危害畜牧業(yè)發(fā)展。因此，建立伯氏疏螺旋體快速、準(zhǔn)確的診斷方法，對萊姆病防控具有重要意義。

伯氏疏螺旋體的檢測主要從病原體分離培養(yǎng)、血清免疫學(xué)以及核酸檢測三個方面開展。分離培養(yǎng)并獲得病原體是萊姆病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，有著不可替代的作用。但該方法耗時、培養(yǎng)條件苛刻、分離率低，在臨床檢測中逐漸被其他方法所替代。血清學(xué)檢測方法常用的有間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）以及免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot，WB）。但由于伯氏疏螺旋體抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其血清學(xué)診斷存在很多缺陷[10]。近年來，伯氏疏螺旋體的分子檢測以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的PCR 和熒光定量PCR（real-time PCR）應(yīng)用最為廣泛。熒光定量PCR 技術(shù)是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，通過熒光信號積累，獲得檢測結(jié)果，既有普通PCR高靈敏的特點(diǎn)，又有DNA 雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量的優(yōu)點(diǎn)[11]，因此在病原檢測、檢驗(yàn)檢疫以及基礎(chǔ)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。曹杰等[12]在我國首次報道建立了TaqMan 探針熒光定量PCR 方法并用于檢測硬蜱中的伯氏疏螺旋體。本研究采用TaqMan-MGB 探針，以伯氏疏螺旋體16SrRNA 保守序列設(shè)計探針及引物，建立了伯氏疏螺旋體熒光定量PCR 檢測方法，并用其對新疆3 個地區(qū)100 份蜱DNA 樣本進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31（ATCC35210）、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（CVCC1531）、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株（CVCC3762）、鉤端螺線體標(biāo)準(zhǔn)株（DSM21537）：新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 檢測樣品 在新疆伊犁、克拉瑪依、阿拉山口3 個地區(qū)采集蜱300 只。

1.1.3 主要試劑TaqProbe 2×qPCR Mix：購自abm 公司；PCR Mix：購自北京莊盟國際生物基因有限公司；PMD18-T 載體：購自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒：購自天根生化科技有限公司；微量DNA 提取試劑盒：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器 實(shí)時熒光定量PCR 儀：Applide Biosystems QuantStudio 5

1.1.5 16SrRNA 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？寺∫?根據(jù)伯氏疏螺旋體16SrRNA 基因序列，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物。上游引物16sA-F：AGAGTTTGATCCTGGCTTAG；下游引物16sAR：TGATCCAGCCGCACTTTCCA。引物由昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.1.6 探針與引物 根據(jù)GenBank 已公開發(fā)表的伯氏疏螺旋體16SrRNA 基因保守序列，設(shè)計TaqMan-MGB 探針及引物（表1），委托上海生物技術(shù)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR 探針及引物

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及蜱DNA 提取 伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株以及鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株DNA 提取，均參照天根公司細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行：將蜱在75%酒精中浸泡15 min，用1×PBS 請洗3 次，然后置于干凈的濾紙上吸水干燥；將干燥后的蜱3 只一組分組，每組加300 μL PBS 研磨至勻漿狀，1 000g離心5 min，取上清，按照微量DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。獲得蜱DNA 樣品共100份，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16SrRNA 基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 以伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31 基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將目的片段膠回收，然后連接PMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提取質(zhì)粒測定濃度。

1.2.3 擴(kuò)增體系及程序 PCR 反應(yīng)體系按照試劑盒要求，冰上配制20 μL 反應(yīng)體系，具體見表2。以提取的伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31 基因組DNA 為陽性對照，反應(yīng)程序設(shè)為95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40 個循環(huán)。

表2 PCR 反應(yīng)體系

1.2.4 敏感性檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 分光光度儀測定伯氏疏螺旋體16SrRNA 基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為102 ng/μL，載體片段與16SrRNA 擴(kuò)增片段長度共為4 214 bp。利用公式（1），計算16SrRNA基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)。10 倍系列稀釋伯氏疏螺旋體16SrRNA 基因重組質(zhì)粒，分別以108、107、106、105、104、103、102、101、100copies/μL 為 模板，進(jìn)行real-time PCR 擴(kuò)增，分析該方法的敏感性。以16SrRNA 基因重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品108～101copies/μL進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，每個梯度設(shè)置3 個復(fù)孔，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

拷貝數(shù)（copies/L）=[6.02×1023×質(zhì)粒質(zhì)量濃度（ng/μL）×10-9]/[DNA 長度（bp）×660]（1）

1.2.5 特異性檢測 分別以伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株以及鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA 為模板，進(jìn)行real-time PCR 擴(kuò)增，分析該方法的特異性。

1.2.6 蜱DNA 樣品檢測 將從伊犁、克拉瑪依、阿拉山口3 個地區(qū)采集蜱提取的基因組DNA 100份為模板，利用建立的TaqMan-MGB 探針熒光定量PCR 方法檢測伯氏疏螺旋體。

2 結(jié)果

2.1 敏感性測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

伯氏疏螺旋體16SrRNA 基因重組質(zhì)粒拷貝數(shù)為2.2×1010copies/μL。將重組質(zhì)粒稀釋，取108～100copies/μL 為模板進(jìn)行realtime PCR 擴(kuò)增，可見該方法檢測標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒靈敏度為102copies/μL（圖1）。從建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）可知，斜率為-3.533 4，截距為44.67，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，表明該方法誤差較小。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒不同拷貝數(shù)熒光定量 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 熒光定量PCR 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 特異性檢測

以伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株以及鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA 為模板，滅菌水為空白對照，進(jìn)行real-time PCR 擴(kuò)增，可見僅伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31 出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖3），Ct 為28.747，其余模板無擴(kuò)增曲線，均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。

2.3 蜱樣品檢測

對新疆3 個地區(qū)采集的100 份蜱DNA 樣本進(jìn)行real-time PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)7 份樣本出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，其余均為陰性。伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株B31擴(kuò)增良好，Ct 為28.440，而鉤端螺旋體無擴(kuò)增（圖4）。

圖3 熒光定量PCR 特異性檢測結(jié)果

圖4 熒光定量PCR 檢測蜱DNA 結(jié)果

3 討論

新疆是萊姆病疫源地[13]，人萊姆病平均感染率高達(dá)35.49%[14]。近年來，由于新疆畜牧業(yè)不斷發(fā)展，動物養(yǎng)殖數(shù)量增大，養(yǎng)殖動物被蜱蟲叮咬機(jī)會增多，患病動物數(shù)量不斷增加且感染后并未引起重視，成為了萊姆病病原體的貯存宿主，造成該病的疫源地不斷擴(kuò)大，以及人群感染率上升[15]。目前針對萊姆病防治，缺乏有效的疫苗及治療藥物，因此控制媒介傳播、加強(qiáng)檢測是降低萊姆病暴發(fā)和流行的重要手段。

萊姆病實(shí)驗(yàn)室診斷中的聚合酶連反應(yīng)（PCR）技術(shù)，因快速簡便、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來不斷得到發(fā)展和應(yīng)用。該技術(shù)彌補(bǔ)了伯氏疏螺旋體培養(yǎng)困難、耗時長以及血清學(xué)檢測易造成假陰性或假陽性的缺點(diǎn)，已用于萊姆病病人受損皮膚組織、血液、關(guān)節(jié)液、腦脊液以及宿主動物血液、臟器和蜱伯氏疏螺旋體的檢測[16]。傳統(tǒng)PCR 技術(shù)對血液、血清以及血漿中伯氏疏螺旋體檢測的靈敏度較低。而在PCR 定性基礎(chǔ)上發(fā)展起來的熒光定量PCR 技術(shù)的檢測靈敏性得到大大提高，且特異性和可靠性更強(qiáng)，可用于萊姆病疑似病人及動物的各組織DNA 及體液的檢測[17-18]。熒光定量PCR 分為探針類和染料類。前者由于增加了探針識別步驟，特異性更高，后者則簡便易行，成本較低。熒光標(biāo)記探針可分為水解探針和雜交探針。目前應(yīng)用較為廣泛的是TaqMan 水解探針法。Fu等[19]通過建立TaqMan探針熒光定量 PCR方法，完成了對我國部分地區(qū)蜱以及血液樣品中的伯氏疏螺旋體檢測。TaqMan-MGB 探針與常規(guī)TaqMan探針不同在于，前者是在TaqMan 探針3'端增加小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB）水解探針。該修飾顯著提高了探針與模板結(jié)合的TM 值，增加了探針的雜交穩(wěn)定性，使結(jié)果更加精確[20]，并且探針3'端單一堿基錯配，可抑制探針與模板的結(jié)合，因而提高了探針的特異性。

4 結(jié)論

本研究選取伯氏疏螺旋體16SrRNA 基因保守序列，設(shè)計特異性引物以及TaqMan-MGB 探針，并通過一系列優(yōu)化建立了TaqMan-MGB 探針熒光定量PCR 方法。該方法具有較高的敏感性和特異性，可為今后新疆地區(qū)有效開展萊姆病檢測及防控提供技術(shù)支撐。