吳立煬，王福廣，查云峰，葉 健，劉 劼，許秀瓊，孫彥偉

（廣東省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510230）

H9 亞型禽流感病毒自1966 年首次從北美火雞中分離到以來，逐漸在世界范圍內(nèi)流行。我國(guó)自1994 年在廣東省雞群中首次分離到H9N2 亞型禽流感病毒[1]以來，共發(fā)生兩次H9N2流感大流行：1998 年首次流行，以Beijing/94 亞群為主；2008年第2 次流行，以Y280 亞群為主[2]。目前，我國(guó)H9 亞型禽流感病毒核酸檢出率居高不下，以隱性感染為主。此外，H9N2 亞型禽流感病毒與其他亞型流感病毒感染同一宿主并在宿主體內(nèi)復(fù)制過程中，能為其他亞型流感病毒提供內(nèi)部基因，使其重組為新型流感病毒，如1997 年感染人的H5N1亞型禽流感病毒和2013 年感染人的H7N9 亞型流感病毒[2]，這對(duì)病毒變異和跨種傳播起到了重要作用。

本研究對(duì)廣東省2017—2018 年檢出的13 株H9 亞型禽流感病毒HA 基因進(jìn)行序列測(cè)定以及對(duì)基因內(nèi)部位點(diǎn)進(jìn)行分析，了解其變異情況，為H9亞型禽流感的有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 13 份咽/肛拭子樣品，為本中心2017—2018 年常規(guī)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中檢出的部分陽(yáng)性樣品，來源于廣東省9 個(gè)市的活禽市場(chǎng)。

1.1.2 試劑 核酸抽提試劑盒（磁珠法），購(gòu)自上海拜諾生物科技有限公司；PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2、載體PMD-18T 和DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TAKARA）；瓊脂糖，購(gòu)自BIOWEST；切膠回收試劑盒，購(gòu)自Promega；GenGreen nucleic acid gel stain 顯色劑，購(gòu)自廣州盈懋分析測(cè)試技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 HA 基因擴(kuò)增引物 根據(jù)禽流感病毒RT-PCR 檢測(cè)方法（NY/772—2013），合成1 對(duì)甲型流感通用引物：上游引物5'-GGGAGCAAAAGCAGGGG-3'；下游引物5'-GGAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3'。引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA 提取 按核酸抽提試劑盒（磁珠法）操作說明書提取RNA。

1.2.2 HA 基因擴(kuò)增 上下游引物各1 μL（濃度為0.025 nmol/μL），Prime Script 1 step Enzyme Mix 2 μL，2×1 step Buffer 25 μL，RNase Free dH2O 11 μL，樣品 RNA 10 μL。擴(kuò)增條件：50 ℃30 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 2 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃8 min，1 個(gè)循環(huán)；4 ℃終止。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物回收和轉(zhuǎn)化 對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后，在藍(lán)光切膠儀中切下目的片段，按切膠回收試劑盒使用說明書進(jìn)行目標(biāo)片段回收；與載體PMD-18T 進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，通過氨芐培養(yǎng)基篩選得到轉(zhuǎn)化成功菌液，再利用RT-PCR 檢測(cè)目的片段是否與載體PMD-18T 連接成功。

1.2.4 目的基因核苷酸序列測(cè)定和分析 將陽(yáng)性樣品送上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序。使用DNAstar 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，以在GeneBank 下載的8 株H9 亞型禽流感病毒HA 基因序列作為參考，使用Megalign 軟件進(jìn)行HA 基因序列比對(duì)，使用Mega 7.0 軟件繪制HA 基因進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA 基因遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)Jiang 等[3]建立的遺傳進(jìn)化樹分類體系，發(fā)現(xiàn)本研究的13 株H9 亞型禽流感病毒均屬于h9.4.2.5 分支，同源性介于94.4%～99.6%。而目前的疫苗毒株 A/Chicken/Guangdong/SS/94、A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Chicken/Shandong/6/96均屬于h9.4.2.2 分支，流行毒株與疫苗毒株同源性為88.2%～90.0%。詳見圖1。

2.2 潛在糖基化位點(diǎn)分析

圖1 H9 亞型禽流感HA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

氨基酸序列分析表明，H9 亞型禽流感病毒HA 的潛在糖基化位點(diǎn)一般分別位于29～31、82～84、141～143、218～220、298～300、305～307、313～315、492～494、551～553 aa 等9 個(gè)位點(diǎn)上，1～7 位于HA1 上，8～9 位于HA2 上。但與參考毒株A/Chicken/Beijing/1/1994 相比，本研究的13 個(gè)毒株均存在218～220 aa 位點(diǎn)的缺失和313～315 aa位點(diǎn)的增加，與參考毒株A/Chicken/Guangdong/G2478/2018 相同。詳見表1。

2.3 裂解位點(diǎn)與受體結(jié)合位點(diǎn)分析

裂解位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，13 個(gè)毒株裂解位點(diǎn)均為RSSR/GLF，呈低致病性禽流感分子特征。構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的7 個(gè)氨基酸（109、161、163、191、198、202、203 aa），均 為YWTNTLY。與A/Chicken/Beijing/1/94 相比，均出現(xiàn)V198T 突變，與A/Chicken/Guangxi/55/2005 和A/Chicken/Guangdong/G2478/2018 相同。受體結(jié)合位點(diǎn)右緣146～150 位有11 個(gè)毒株出現(xiàn)K149N 和A150T 突變，與中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心分離到的毒株A/Chicken/Guangdong/G2478/2018 相同，另有2 個(gè)毒株出現(xiàn)K149T 突變。受體結(jié)合位點(diǎn)左緣232～237 位，13 個(gè)毒株均出現(xiàn)Q234L 和Q235M突變。詳見表2。

表1 潛在糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果

2.4 HA 抗原相關(guān)位點(diǎn)分析

HA 蛋 白G90E、S145D、D153G、N167G、A168D、T200R、N201D 等氨基酸突變（H9 編碼）[4-6]與H9N2 亞型禽流感病毒抗原變異相關(guān)。本研究對(duì)13 株H9 亞新禽流感病毒的7 個(gè)抗原位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有毒株均在145、153、167、200 aa 位點(diǎn)出現(xiàn)上述突變，90 aa 位點(diǎn)有12 個(gè)毒株出現(xiàn)G90E 突變，168 aa 位點(diǎn)有12 個(gè)毒株出現(xiàn)A168N 突變，表明當(dāng)前H9 亞型禽流感的抗原性發(fā)生了較大程度的變異。詳見表3。

3 討論

3.1 當(dāng)前流行株分類學(xué)地位

本研究的13 個(gè)毒株均屬于h9.4.2.5 分支，表明當(dāng)前廣東省的H9 亞型禽流感優(yōu)勢(shì)流行株為h9.4.2.5 分支的毒株。3 個(gè)經(jīng)典疫苗毒株 A/Chicken/Guangdong/SS/94、A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Chicken/Shandong/6/96 均屬于h9.4.2.2 分支，與流行毒株同源性僅為88.2%～90.0%，表明當(dāng)前廣東省流行毒株與疫苗株出現(xiàn)了較大的遺傳差異。

3.2 流行毒株致病性變化的分子基礎(chǔ)分析

13 株H9 亞型禽流感病毒的HA 基因序列裂解位點(diǎn)均為RSSR/GLF，呈低致病性禽流感分子特征。糖基化位點(diǎn)主要表現(xiàn)為218～220 aa 位點(diǎn)的缺失和313～315aa 位點(diǎn)的增加。這些糖基化位點(diǎn)的變化是否會(huì)影響病毒特性仍有待進(jìn)一步研究。受體結(jié)合位點(diǎn)主要表現(xiàn)為K149N、A150T、V198T、Q234L 和Q235M 位點(diǎn)的突變，與劉彥云等[7]的研究結(jié)果相比，RBS 增加了K149N、A150T、Q235M 三個(gè)位點(diǎn)的突變。Ha 等[8]研究表明，HA蛋白R(shí)BS 的234～236 aa 位點(diǎn)突變?yōu)長(zhǎng)MG，與人源受體相同，具有與SA-2,6-Gal 結(jié)合的能力。本研究中13 個(gè)毒株HA 蛋白R(shí)BS 的234～236 aa 位點(diǎn)均突變?yōu)長(zhǎng)MG，具備感染人類的可能性。抗原性相關(guān)位點(diǎn)除了201 aa 位點(diǎn)較為保守外，其余6 個(gè)位點(diǎn)主要表現(xiàn)為G90E、S145D、D153G、N167G、A168N、T200R 位點(diǎn)的突變，還有168 aa 由天冬氨酸（D）突變?yōu)樘於０罚∟），并成為主要氨基酸。它可能導(dǎo)致H9 亞型禽流感病毒發(fā)生抗原漂移以逃避疫苗免疫[9]。2017—2018 年，本中心監(jiān)測(cè)的H9 亞型禽流感抗體合格率分別為80.84%和81.34%，禽群抗體合格率保持在70%以上的有效保護(hù)[10]水平，但流通環(huán)節(jié)H9 亞型禽流感病毒檢出率逐年上升，推測(cè)目前使用的疫苗與流行毒株匹配度較低，只能提供有限的保護(hù)，應(yīng)考慮以當(dāng)前的流行毒株研發(fā)新的疫苗毒株。

表2 裂解位點(diǎn)與受體結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果

表3 HA 抗原相關(guān)位點(diǎn)分析結(jié)果