敏娜， 吳振起， 劉光華

環(huán)境污染威脅人類的健康，大氣污染是環(huán)境污染中最重要的組成部分，而大氣顆粒物是大氣污染的主要組成部分，大氣顆粒物對(duì)人體具有毒性強(qiáng)、危害大的特性，可導(dǎo)致各個(gè)系統(tǒng)發(fā)病率的升高，尤其是以PM2.5為主引發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。PM2.5的顆粒面積較大且密度較低，在空氣中的浮力較大，因此PM2.5可以長(zhǎng)期滯留在空氣中。且PM2.5易吸附空氣中的重金屬、微生物等有毒物質(zhì)，PM2.5及其吸附的有毒物質(zhì)可以通過呼吸道途徑被人體吸入，因此PM2.5可導(dǎo)致肺炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管炎等多種呼吸系統(tǒng)疾病[2]。

流感病毒(influenza virus，IV)是一類具有高發(fā)病率和高死亡率的傳染性病毒，其所致感染性疾病可引起全球范圍內(nèi)流行。亦為引起人類上呼吸道感染、肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原之一[3]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)霧霾天氣頻繁出現(xiàn)，兒童、老年人等弱勢(shì)群體IV感染率明顯升高[4]。IV極易附著于PM2.5等顆粒侵襲人體，造成鼻黏膜損傷。因此本研究通過構(gòu)建霧霾及IV感染小鼠模型，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)小鼠血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、鼻咽灌洗液中分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)的含量，免疫組織化學(xué)SP法及Western-blot法檢測(cè)小鼠肺中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(surfactant-associated protein A，SP-A)的表達(dá)，探討3種造模方式對(duì)肺部造成不同程度的損傷，由此來(lái)進(jìn)一步研究其致炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 甲型IV A/FM1/47(H1N1)小鼠適應(yīng)株，病毒株由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠72只，雌雄各半，平均體質(zhì)量(18±2)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2013-0009]，在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，水和飼料經(jīng)高溫高壓消毒后使用。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～22 ℃，濕度(50±2)%，12 h/12 h明暗周期，分籠飼養(yǎng)，正常組與感染組小鼠分房飼養(yǎng)。

1.1.3 PM2.5顆粒提取及懸液制備 將附有PM2.5顆粒的玻璃纖維濾膜剪成1 cm×3 cm大小，放入250 mL燒杯；加入無(wú)菌超純水，低溫超聲1 h×3次，每隔5 min輕輕搖晃燒杯，以混勻懸浮液；將燒杯中的懸浮液倒至已稱重的離心管中；然后用超純水清洗留在燒杯中的膜2～3次，收集懸浮液至同一個(gè)離心管中；使用6層紗布過濾懸液，低溫冷凍干燥離心管，稱重，計(jì)算收獲顆粒物質(zhì)量，回收顆粒于-20 ℃冰箱保存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)小鼠的體重稱取PM2.5顆粒物，于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前一天用雙蒸水配置細(xì)顆粒物混懸液，超聲振蕩混勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用前再次超聲振蕩混勻?/p>

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 ELISA試劑盒購(gòu)自mlbio；sIgA(貨號(hào)：ml001917)、TNF-α(貨號(hào)：ml002095)；二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒購(gòu)自BOSTER(貨號(hào)：AR1022)；抗體購(gòu)自BOSTER：SP-A(貨號(hào)：BA2598)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(貨號(hào)：BA2913)；鏈酶親和素-堿性磷酸酶(兔IgG，貨號(hào)：SA1052)，免疫印跡試劑盒(兔IgG，貨號(hào)：EK1002)。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 TP1020型自動(dòng)組織脫水機(jī)(LEICA)，BX50F4型顯微鏡(OLYMPUS)，RM2135型切片機(jī)(LEICA)，EG1150型石蠟包埋機(jī)(LEICA)，酶標(biāo)儀(Thermo)，低溫高速離心機(jī)(Heraeus)，蛋白成像和定量分析系統(tǒng)(Proteinsimple)，電泳儀(Bio-Rad)，Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將72只BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、PM2.5感染組、IV感染組和聯(lián)合感染組，每組18只。對(duì)各組小鼠稱重并標(biāo)號(hào)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d。

1.2.2 模型制備 將正常組小鼠置于溫度濕度適宜的無(wú)菌空間，然后對(duì)其余各組小鼠進(jìn)行造模處理。造模第1天，將PM2.5感染組、聯(lián)合感染組放入人工氣候培養(yǎng)箱中濕度(80±5)%，溫度(22±2)℃ 2 h，取出后用8.9 g/L PM2.5混懸液進(jìn)行氣管滴注(50 μL/只)，隔日1次，共3次。操作方法依照文獻(xiàn)[5]。造模第7天，IV感染組、聯(lián)合感染組采用乙醚麻醉，通過鼻腔滴注途徑接種甲型IV FM1株，劑量為0.1 mL/只。

1.2.3 標(biāo)本采集 于造模后第3、7、10天采集標(biāo)本，每組取6只，稱重后，摘除眼球取血，接儲(chǔ)存于促凝管中，后放入離心機(jī)中以5 000 r/min離心5 min(離心半徑9.5 cm)，離心后取上層血清，存于EP管中。予小鼠行頸椎脫臼處死，無(wú)菌打開胸腔，暴露氣管，用5 mL注射器(針頭磨鈍圓)向下順插入氣管，結(jié)扎，抽取1 mL生理鹽水向上沖洗鼻咽部，收集從鼻部流出的沖洗液，重復(fù)2次，存于EP管中。放入-80 ℃冰箱中冷凍以備檢測(cè)。

1.2.4 光鏡下病理組織學(xué)觀察 用4%多聚甲醛固定的組織包埋成蠟塊，切片機(jī)切成薄片約5 μm，蘇木精-伊紅染色后在光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)小鼠血清TNF-α、鼻咽灌洗液sIgA表達(dá)水平 在感染后的第3、7、10天對(duì)小鼠進(jìn)行摘眼球取血，離心后取上清液，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。按ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定小鼠血清中TNF-α和鼻咽灌洗液中sIgA的表達(dá)。

1.2.6 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)小鼠肺組織SP-A的表達(dá) 取肺組織石蠟切片，采用SP免疫組織化學(xué)法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，分別滴加一抗(SP-A 1∶200)，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，二氨基聯(lián)苯胺顯色。采用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行分析，統(tǒng)一參數(shù)設(shè)定保持基線一致，測(cè)定平均光密度值(IOD/area)，作半定量分析。

1.2.7 Western Blot法檢測(cè)小鼠肺組織SP-A蛋白的表達(dá) 用總蛋白提取試劑提取總蛋白，離心取上清液，-20 ℃冰箱中保存。采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，用蒸餾水調(diào)整到統(tǒng)一濃度，提取液中加入5×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，蛋白上樣每孔含10 μL，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜30 min，2%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。一抗室溫孵育2 h，4 ℃過夜，三乙醇胺緩沖鹽水溶液+吐溫20(TBST)10 min/次洗膜(3次)，二抗室溫孵育1 h，TBST 10 min/次洗膜(3次)。化學(xué)發(fā)光，F(xiàn)luor Chem Q蛋白質(zhì)印跡，成像系統(tǒng)顯色。

2 結(jié)果

2.1 肺組織光鏡病理組織學(xué)觀察 正常組小鼠肺泡、肺泡隔及肺泡囊形態(tài)較為完整，周圍血管未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1a，見封三)。PM2.5感染組小鼠可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于肺組織，并可見其背膜增厚(圖1b，見封三)。IV感染組小鼠肺泡內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞，支氣管黏膜上皮水腫(圖1c，見封三)。聯(lián)合感染組小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔等結(jié)構(gòu)消失，肺泡間隔增厚，細(xì)支氣管壁增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張(圖1d，見封三)。

2.2 小鼠血清中TNF-α、鼻咽灌洗液中sIgA含量檢測(cè) 分別見表1、2。

表1 各組小鼠血清TNF-α含量檢測(cè)結(jié)果

注：與聯(lián)合感染組比較，aP<0.05。

表1結(jié)果表明，小鼠感染后其血清中TNF-α含量均顯著升高，并于第7天達(dá)到峰值。各感染組各時(shí)間點(diǎn)均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第10天IV感染組TNF-α含量顯著高于PM2.5感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第3，7天兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合感染組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α含量顯著高于PM2.5感染組和IV感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠鼻咽灌洗液中sIgA含量檢測(cè)結(jié)果

注：與聯(lián)合感染組比較，aP<0.05。

表2結(jié)果表明，小鼠感染后其鼻咽灌洗液中sIgA含量均顯著降低，且于第7天降到谷值。各感染組各時(shí)間點(diǎn)均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IV感染組sIgA各時(shí)間點(diǎn)sIgA含量與PM2.5感染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合感染組各時(shí)間點(diǎn)sIgA含量顯著低于PM2.5感染組和IV感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)肺組織SP-A蛋白的表達(dá) 分別見表3和圖2(見封三)。

表3 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)各組小鼠肺組織SP-A蛋白的表達(dá)

注：與聯(lián)合感染組比較，aP<0.05。

表3結(jié)果表明，小鼠感染后其肺組織中SP-A蛋白的表達(dá)顯著降低，并于第7天降到谷值。各感染組各時(shí)間點(diǎn)均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IV感染組各時(shí)間點(diǎn)SP-A蛋白的表達(dá)與PM2.5感染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合感染組各時(shí)間點(diǎn)SP-A蛋白的表達(dá)顯著低于PM2.5感染組和IV感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 Western-blot檢測(cè)SP-A蛋白表達(dá)水平 分別見表4和圖3。

表4 Western-blot檢測(cè)各組小鼠肺組織中SP-A蛋白的表達(dá)

注：與聯(lián)合感染組比較，aP<0.05。

表4結(jié)果表明，小鼠感染后其肺組織中SP-A蛋白的表達(dá)顯著降低，并于第7天降到谷值。各感染組各時(shí)間點(diǎn)均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IV感染組各時(shí)間點(diǎn)SP-A蛋白的表達(dá)顯著低于PM2.5感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合感染組各時(shí)間點(diǎn)SP-A蛋白的表達(dá)顯著低于PM2.5感染組和IV感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

a：正常組，b：PM2.5感染組，c：IV感染組，d：聯(lián)合感染組

3 討論

流感是由一種由IV引發(fā)的急性呼吸道傳染病。其傳播途徑主要有兩種：人與人的接觸或人與帶有IV的物品接觸。有研究表明，近年來(lái)IV患病率急劇上升可能與霧霾天氣有關(guān)[6]。很多季節(jié)性的流感的爆發(fā)與霧霾天氣有著密切的聯(lián)系[7-8]?？諝庵械募?xì)顆粒物質(zhì)(PM2.5)對(duì)肺組織的損傷可能導(dǎo)致肺部免疫力下降，進(jìn)而更容易感染IV[9]。王璐璐等[10]通過建立并分析空氣中的細(xì)顆粒物質(zhì)對(duì)流感傳播影響的動(dòng)力學(xué)模型得出結(jié)論：空氣中的細(xì)顆粒物質(zhì)能加重流感的傳播。霧霾是霧與霾的統(tǒng)稱，霧霾包括懸浮在近地面空氣中的氣溶膠系統(tǒng)和空氣中的灰塵、硫酸等有機(jī)碳?xì)浠衔锪Ｗ咏M成[11]。霧霾的成因是氣候條件和人類活動(dòng)共同作用產(chǎn)生的。霧霾中的細(xì)顆粒物質(zhì)已經(jīng)成為一個(gè)檢測(cè)空氣污染指數(shù)的重要指標(biāo)。研究顯示，霧霾可以通過呼吸直接進(jìn)入人體內(nèi)部，黏附于人體的呼吸道及肺葉中，從而導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)的損傷，進(jìn)而誘發(fā)或加重流感等多種疾病[12]。

如今，霧霾已經(jīng)成為了一種新的IV傳播途徑，其對(duì)IV傳播的快速和廣泛性已經(jīng)受到了很多學(xué)者的關(guān)注。通過研究IV與霧霾聯(lián)合作用于肺部具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過比較IV感染和霧霾聯(lián)合IV感染造模后，各組中肺組織、血清、灌洗液等指標(biāo)的改變情況，分析霧霾聯(lián)合IV造模的理論及現(xiàn)實(shí)意義。

黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗IV的第一道防線，它不僅是一道防御的屏障，還參與了機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的過程[13]。sIgA是黏膜表面最重要的抗體，也是作為病毒感染的重要檢測(cè)指標(biāo)。大量研究表明，sIgA在IV感染的模型中呈低表達(dá)[14-16]。有研究表明，IV感染可加劇肺組織的炎癥反應(yīng)，TNF-α是一種重要的炎癥因子，可協(xié)同白細(xì)胞介素-1作用于肺部炎性細(xì)胞因子，并產(chǎn)生多種細(xì)胞炎癥因子(如白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8)，從而啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。當(dāng)TNF-α表達(dá)上調(diào)時(shí)，可誘發(fā)肺部白細(xì)胞遷移、肺內(nèi)皮細(xì)胞活化，誘發(fā)或加重炎癥反應(yīng)。有研究表明，IV導(dǎo)致肺部病變的部分原因可能是TNF-α過度表達(dá)有關(guān)[18]。而炎癥反應(yīng)可能是抑制SP表達(dá)的重要因素。SP分為SP-A、-B、-C、-D四個(gè)成員，其中SP-A是SP中表達(dá)量最豐富的蛋白組分，已被證實(shí)是對(duì)抗呼吸道病原體和過敏原的重要宿主防御成分[19]。有研究表明，SP-A可以黏附IV，并可介導(dǎo)吞噬細(xì)胞黏附IV，此外SP-A還可以抑制IV的傳染力和復(fù)制能力[20-22]。

本研究結(jié)果顯示，各感染組小鼠鼻咽灌洗液中sIgA含量均下調(diào)，其中以PM2.5氣管滴注聯(lián)合IV感染小鼠sIgA含量下調(diào)最為顯著，此結(jié)果初步提示PM2.5氣管滴注聯(lián)合IV感染小鼠的黏膜免疫能力降低。HE染色結(jié)果顯示，與正常組比較，各感染組的肺組織均有不同程度的破壞，其中以PM2.5氣管滴注聯(lián)合IV感染小鼠中肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度最為顯著且出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示PM2.5可能會(huì)加劇肺組織的損傷并促進(jìn)IV的感染，且肺組織損傷與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)。同時(shí)，各感染組小鼠血清中TNF-α的表達(dá)均上調(diào)，其中以PM2.5氣管滴注聯(lián)合IV感染小鼠血清中TNF-α的表達(dá)上調(diào)最為顯著，于第7天達(dá)到峰值。免疫組織化學(xué)與Western Blot結(jié)果顯示，各感染組小鼠肺組織內(nèi)SP-A蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，且PM2.5氣管滴注聯(lián)合IV感染小鼠效果最為顯著。上述結(jié)果說(shuō)明IV感染導(dǎo)致肺組織炎癥反應(yīng)加劇，TNF-α的表達(dá)上調(diào)，而炎癥反應(yīng)的加劇又抑制了SP-A蛋白的活性，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)抗呼吸道病原體的能力進(jìn)一步減弱。

綜上所述，本試驗(yàn)分別從病理學(xué)、分子生物學(xué)角度共同說(shuō)明：在采用PM2.5氣管滴注聯(lián)合IV感染對(duì)小鼠進(jìn)行造模后，其成模的顯著性高于單一IV造模。由于霧霾天氣導(dǎo)致IV傳播速度急劇上漲，所以采用PM2.5氣管滴注聯(lián)合IV感染對(duì)小鼠進(jìn)行造模更具有理論研究?jī)r(jià)值及現(xiàn)實(shí)研究意義。為臨床上預(yù)防和治療流感提供了理論依據(jù)，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。