易卓 夏立秋 丁學(xué)知 胡勝標(biāo) 羅玉雙 王海龍 唐瀅 黃鑫

(1 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建淡水魚(yú)類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410081；2 益陽(yáng)廣播電視大學(xué) 開(kāi)放教育學(xué)院，益陽(yáng) 413000)

多殺菌素類化合物(spinosyns)是由土壤放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)經(jīng)有氧發(fā)酵后產(chǎn)生的胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，是一種新型的極具前景的綠色廣譜生物殺蟲(chóng)劑。其主要活性成分為spinosyn A和spinosyn D，其中A組分約占85%～90%，D組分約占10%～15%，因此被命名為spinosad，中文名為多殺菌素[2-3]。與一般殺蟲(chóng)劑相比，多殺菌素具有見(jiàn)效快，無(wú)副作用，選擇性強(qiáng)，半衰期短，易降解，產(chǎn)生抗性的可能性低，兼有化學(xué)農(nóng)藥的速效性和生物農(nóng)藥的安全性。當(dāng)其濃度為1mg/L時(shí)能保護(hù)谷物至少4個(gè)月[4]，可用于防治蔬菜、水果等農(nóng)作物害蟲(chóng)[5]，因此已經(jīng)在許多作物上有所應(yīng)用[6]。多殺菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類化合物，由一個(gè)四環(huán)結(jié)構(gòu)骨架外加連結(jié)的兩個(gè)不同的六碳糖組成。兩個(gè)六碳糖中一個(gè)是福樂(lè)糖，另一個(gè)是鼠李糖[7](圖1)。自從Boeck等[8]首次從S.spinosaNRRL-18395培養(yǎng)物中分離出了多殺菌素組分A～E、F、H、J和spinosad A假糖苷配基以來(lái)，已經(jīng)分離到20多種多殺菌素類化合物(spinosyns A-Y)，并且它們的結(jié)構(gòu)都已得到闡明。在所有天然多殺菌素分離提取物中，兩個(gè)最高活性組分是 spinosyn A和D，其差別在于聚酮骨架C6上取代基是甲基還是氫。

圖1 多殺菌素類化合物的分子結(jié)構(gòu)[7]Fig.1 Structure of spinosyns

目前對(duì)刺糖多孢菌進(jìn)行遺傳改良主要是從兩方面入手：一是理化誘變與篩選。常規(guī)理化誘變育種是提高多殺菌素產(chǎn)量的有效方法，應(yīng)用普遍，但該方法有著工作量大及不能定向等缺點(diǎn)[9-12]。二是定向的基因改造。增加編碼限速酶基因的拷貝數(shù)或者修飾調(diào)節(jié)基因可能提高多殺菌素產(chǎn)量。在刺糖多孢菌中，鼠李糖的合成既用于細(xì)胞壁的合成，也用于產(chǎn)生多殺菌素。而在多殺菌素的兩個(gè)糖基鼠李糖和福樂(lè)糖胺的生物合成過(guò)程中，前期兩個(gè)步驟又是共同的。Madduri等[13]將同時(shí)帶有限速酶基因gtt、gdh和kre的質(zhì)粒整合到S.spinosa染色體中，發(fā)現(xiàn)重組菌株的多殺菌素產(chǎn)量是原始菌的3倍。Pan等[14]通過(guò)使gtt、gdh基因分別在強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*控制之下，并整合到S.spinosa染色體中，使多殺菌素產(chǎn)量提高3倍多，達(dá)到800μg/mL。Tang等[15]通過(guò)Red/ET同源重組技術(shù)直接克隆了參與轉(zhuǎn)化環(huán)形聚酮化合物到多殺菌素的約18kb基因簇，同樣使多殺菌素產(chǎn)量提高近3倍。肖潔等[16]使調(diào)節(jié)基因gln A在強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*控制之下，并整合到S.spinosa染色體中，使多殺菌素產(chǎn)量相比原始菌株提高到170%。定向的基因改造相比于理化誘變與篩選方法雖有周期短、工作量小的優(yōu)點(diǎn)，但局限于對(duì)菌株代謝調(diào)控的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因進(jìn)行操作，且刺糖多孢菌的限制修飾系統(tǒng)使得外源質(zhì)體轉(zhuǎn)入胞內(nèi)的效率低下[17-18]。

原生質(zhì)體融合是工業(yè)上微生物育種中定向選育優(yōu)勢(shì)菌株的最有效方法之一，應(yīng)用廣泛。不同菌株的優(yōu)勢(shì)基因在原生質(zhì)體融合之后能夠發(fā)生重組，這樣有著優(yōu)良性狀的融合菌株可能獲得。該方法能夠繞過(guò)一些障礙，如對(duì)菌體基因組信息不了解、代謝調(diào)控所知甚少、遺傳修飾系統(tǒng)不成熟等情況，直接達(dá)到育種目的。近年來(lái)，該方法已成功地應(yīng)用于在天藍(lán)色鏈霉菌上發(fā)現(xiàn)新的中間產(chǎn)物及具有優(yōu)良特性的雜合抗生素[19]、大范圍提升代謝物產(chǎn)量[20-21]、改進(jìn)乳酸桿菌酸抗性[22-23]、提升鞘氨醇桿菌(Sphingobium chlorophenolicum)對(duì)五氯苯酚抗性[24]和增加鏈霉菌對(duì)(2S,3R)-檸檬酸的抗性[25]。最近，對(duì)刺糖多孢菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合操作也有所報(bào)道。Jin等[26]首先通過(guò)亞硝基胍和紫外線輻射復(fù)合誘變得到一株多殺菌素產(chǎn)量提高78.43%的突變株UN-90，然后將UN-90進(jìn)行4輪原生質(zhì)體融合處理，得到了一株高產(chǎn)菌株刺糖多孢菌4-7，其產(chǎn)量比UN-90和原始菌株分別提高了200.55%和436.27%。Wang等[27]分別制備野生型刺糖多孢菌和阿維鏈霉菌的原生質(zhì)體，然后對(duì)其進(jìn)行紫外輻射處理，將兩者原生質(zhì)體融合，得到兩株高產(chǎn)菌株F17和F70，其多殺菌素產(chǎn)量較原始菌株分別提高了447.22%和409.21%。F17與刺糖多孢菌有相似的形態(tài)及產(chǎn)多殺菌素性質(zhì)，并且對(duì)發(fā)酵條件有較強(qiáng)的耐受性。此外，F(xiàn)17還具有利用淀粉作為發(fā)酵唯一碳源的特性，該特性是母本菌阿維鏈霉菌所具有的。

野生型刺糖多孢菌產(chǎn)多殺菌素的生長(zhǎng)發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)2～3周，并且產(chǎn)量低下，使得該種殺蟲(chóng)劑生產(chǎn)成本極高，嚴(yán)重限制了該種殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)和農(nóng)田大面積的應(yīng)用。因此，提高刺糖多孢菌產(chǎn)多殺菌素的能力成為一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。

紅霉素是由放線菌紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)經(jīng)有氧發(fā)酵后產(chǎn)生的一類對(duì)病原性革蘭陽(yáng)性菌具有廣譜活性的抗生素[28]，屬胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物。其主要成分為紅霉素A，由一個(gè)特征性的14元內(nèi)酯大環(huán)外加連接著的兩個(gè)脫氧糖基mycarose和desosamine組成。刺糖多孢菌和紅色糖多孢菌同屬于糖多孢菌屬菌株，親緣關(guān)系較近。紅霉素和多殺菌素生物合成酶同屬于I型聚酮合酶，合成途徑相似。兩種抗生素的生物合成不僅具有共同的合成底物丙酸，而且在兩個(gè)脫氧糖基合成步驟上，同樣具有相似性。本研究嘗試通過(guò)將刺糖多孢菌和紅色糖多孢菌做原生質(zhì)體融合來(lái)篩選高產(chǎn)多殺菌素的融合菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

本研究中所使用的菌株和質(zhì)粒，如表1所示。

1.2 抗生素、培養(yǎng)基

大腸埃希菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B[29]，阿泊拉霉素使用終濃度為50mg/L，氯霉素為25mg/L，卡那霉素為50mg/L，萘啶酮酸為25mg/L。種子活化培養(yǎng)基TSB、產(chǎn)色素固體培養(yǎng)基YMG、大腸埃希菌-紅色糖多孢菌接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基MS和接合子轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基BHI按Kieser等[30]方法配置。再生平板培養(yǎng)基(g/L)[26]：蔗糖100，葡萄糖10，酵母提取物5，蛋白胨0.1，MgCl2·H2O 10，KH2PO40.25,CaCl2·2H2O 3，微量元素溶液2mL，TES緩沖液(5.73%,pH7.2)20mL，瓊脂20，pH值在高壓蒸汽滅菌前調(diào)節(jié)到6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120，棉籽粉32，酵母粉1，豆餅粉6，玉米漿8，碳酸鈣4，pH7.0。

1.3 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶、連接酶、高保真酶及LATaq酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；PCR儀-5415R為Eppendorf公司產(chǎn)品；電轉(zhuǎn)化儀GenepulserTM為Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Kodak公司產(chǎn)品。

1.4 DNA的提取和轉(zhuǎn)化

大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞制備和質(zhì)粒DNA提取、轉(zhuǎn)化等常規(guī)DNA操作參照文獻(xiàn)[29]，紅色糖多孢菌基因組DNA提取及大腸埃希菌-紅色糖多孢菌屬間接合轉(zhuǎn)移操作參照文獻(xiàn)[30]。

1.5 PCR 擴(kuò)增

根據(jù)已知紅色糖多孢菌全基因組序列(AccessionNo.NC_009142)，設(shè)計(jì)引物F1(TTAGAATTCATCG CGCGCTGGCTCGCC，加粗表示EcoRI位點(diǎn))和R1(CGCAAGCTTCATGCCGACGATCGCGAT，加粗表示HindIII位點(diǎn))，以紅色糖多孢菌全基因組為模板擴(kuò)增eryAI基因內(nèi)部1.1kb DNA同源片段。PCR反應(yīng)條件：30μL反應(yīng)體系，94℃ 2min；94℃ 30s，62℃30s，72℃ 1min，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。

表1 菌株和質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids

1.6 原生質(zhì)體融合及融合菌株的篩選

原生質(zhì)體融合參照J(rèn)in等[26,30]的方法。將100μL刺糖多孢菌菌液和100μL重組紅色糖多孢菌菌液接種于相應(yīng)的20mL TSB中，搖瓶30℃活化培養(yǎng)48h，然后兩種菌液分別按2mL接種量標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)接入相應(yīng)的含0.2%甘氨酸的20mL TSB中同樣條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48h。在培養(yǎng)之后，兩種菌液細(xì)胞分別通過(guò)離心(4000g,10min,4℃)收獲，用10mL原生質(zhì)體緩沖液洗2次，然后用溶菌酶處理2h。通過(guò)相差顯微鏡觀察到原生質(zhì)體形成后，將兩種溶液混合，去除溶菌酶(4000g,10min,4℃)。兩種原生質(zhì)體在10mL含有50% PEG1000的原生質(zhì)體緩沖液中融合5min。然后用20mL原生質(zhì)體緩沖液洗原生質(zhì)體2次，離心收集。稀釋后的100μL原生質(zhì)體懸浮液涂布到再生平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。16～20h后涂布終濃度為50mg/L的阿泊拉霉素，平板膠帶封住，倒置繼續(xù)培養(yǎng)10～12d。

經(jīng)過(guò)10～12d培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取再生平板培養(yǎng)基上80個(gè)單菌落連續(xù)在再生平板培養(yǎng)基和YMG平板培養(yǎng)基(含有50mg/L的阿泊拉霉素)上分別轉(zhuǎn)接培養(yǎng)1次，然后搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，HPLC檢測(cè)分析多殺菌素產(chǎn)量。

1.7 搖瓶培養(yǎng)

搖瓶種子液培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度3 0℃，裝量20mL/250mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時(shí)間48h；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度30℃，裝量20mL/300mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速240r/min，培養(yǎng)時(shí)間10d。

1.8 多殺菌素和紅霉素高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)分析

多殺菌素:丙酮與發(fā)酵液1:1體積比例混合，30℃浸提8～10h獲得多殺菌素抽提物，經(jīng)AKTA purifier10高效液相色譜儀純化分析。色譜柱為AQ12S05-1546WT(150mm×4.6mm I.D.S-5μm,12nm)。流動(dòng)相：甲醇/乙腈/2%醋酸銨(V/V/V)= 45/45/10，流速1.5mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.1956476+0.22728109X(X：多殺含量，mg/L；Y：峰值，mAU/mL；相關(guān)系數(shù)：0.9992)，計(jì)算多殺菌素含量。

紅霉素：與多殺菌素檢測(cè)方法類似，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

1.9 質(zhì)譜分析融合菌發(fā)酵所產(chǎn)多殺菌素組分

融合菌株發(fā)酵液中的多殺菌素組分采用HPLCMS儀進(jìn)行分析。樣品用包含有0.1%甲酸的甲醇洗脫，梯度洗脫過(guò)程為甲醇含量從50%變?yōu)?0%，時(shí)間為18min。收集(m/z)范圍為300.00～2000.00的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅色糖多孢菌產(chǎn)紅霉素阻斷表達(dá)載體的構(gòu)建

以紅色糖多孢菌NRRL 2338的全基因組為模板，采用引物L(fēng)1和R1擴(kuò)增紅色糖多孢菌產(chǎn)紅霉素基因簇中的eryAI基因內(nèi)部的1.1kb序列，得到1100bp的目的片段(圖2)。將PCR片段用EcoRI和HindIII雙酶切后與載體pOJ260連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌GB2005得到重組質(zhì)粒pOJ260D。構(gòu)建的整合型載體pOJ260D(圖3)含有1.1kb的同源臂、阿泊拉霉素抗性基因aac3(Ⅳ)、接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT。

2.2 載體pOJ260D在大腸埃希菌與紅色糖多孢菌間接合轉(zhuǎn)移及在染色體上的整合

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pOJ260D轉(zhuǎn)化大腸埃希菌ET12567(pUZ8002)，得到的大腸埃希菌ET12567(pUZ8002,pOJ260D)作為供體菌與紅色糖多孢菌NRRL 2338接合，得到的接合子在含有阿泊拉霉素的BHI平板上傳代生長(zhǎng)2次。挑取轉(zhuǎn)化子并提取基因組DNA，用阿泊拉霉素抗性基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，出現(xiàn)約750bp目的條帶(圖4)。將該轉(zhuǎn)化子命名為紅色糖多孢菌D。

圖2 紅色糖多孢菌eryAI基因內(nèi)部序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳Fig.2 Agrose gel eletrophoresis of PCR products of eryAI gene internal sequence of S.erythraea

圖3 載體pOJ260D圖譜Fig.3 Map of vector pOJ260D

2.3 紅色糖多孢菌D特征分析

構(gòu)建的紅色糖多孢菌D在原生質(zhì)體再生平板培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌落褶皺較野生型紅色糖多孢菌NRRL 2338少，且產(chǎn)色素的量增加(圖5)。將兩種菌株分別發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液HPLC檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)紅色糖多孢菌D不產(chǎn)紅霉素(圖6)。

2.4 原生質(zhì)體融合及融合菌株的篩選

圖4 重組菌株紅色糖多孢菌D的PCR檢測(cè)Fig.4 PCR confirmation of recobinants S.erythraea D

圖5 紅色糖多孢菌D在固體平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of recobinants S.erythraea D grown on solid plates

圖6 構(gòu)建的紅色糖多胞菌D發(fā)酵液的紅霉素HPLC分析Fig.6 HPLC Analysis of erythromycins of fermentation broth of recombinants S.erythraea D

將重組菌株紅色糖多胞菌D與刺糖多孢菌SP06081進(jìn)行原生質(zhì)體融合，融合操作后的原生質(zhì)體稀釋液涂布在再生平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d后，隨機(jī)挑取再生平板培養(yǎng)基上80個(gè)單菌落連續(xù)在再生平板培養(yǎng)基和YMG平板培養(yǎng)基(含有50mg/L的阿泊拉霉素)上分別轉(zhuǎn)接培養(yǎng)1次，然后搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，HPLC檢測(cè)分析多殺菌素產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分菌株不產(chǎn)多殺菌素，獲得4株產(chǎn)多殺菌素的融合菌株(圖7)，分別將其命名為C5、C6、C9和B9，其相對(duì)產(chǎn)量如圖8所示。用野生型刺糖多孢菌SP06081先制備原生質(zhì)體然后讓其直接在再生平板培養(yǎng)基上再生作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)野生型刺糖多孢菌原生質(zhì)體再生后其多殺菌素產(chǎn)量低于原始野生型菌株。

圖7 融合菌株發(fā)酵液的多殺菌素組分的HPLC分析Fig.7 HPLC Analysis of spinosyns of fermentation broth of fused strains

圖8 初次篩選得到的融合菌株的多殺菌素相對(duì)產(chǎn)量Fig.8 Spinosad relative production of fused strains from initial screening

2.5 融合菌株的再次篩選

在原生質(zhì)體再生平板培養(yǎng)基上，刺糖多孢菌產(chǎn)生白色孢子，菌落無(wú)褶皺；紅色糖多孢菌產(chǎn)生粉紅色孢子，菌落褶皺明顯，產(chǎn)紅色色素?；诳股睾Y選融合菌株多殺菌素產(chǎn)量偏低，接下來(lái)參照Wang等[27]的方法，考慮不采用抗生素篩選的方法，將原生質(zhì)體融合后涂布不加阿泊拉霉素的再生平板培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待孢子成熟后直接挑取菌落形態(tài)近似刺糖多孢菌的菌落做搖瓶發(fā)酵，HPLC分析確定多殺菌素產(chǎn)量。隨機(jī)選取27個(gè)單菌落用于搖瓶發(fā)酵檢測(cè)。相比野生型菌株刺糖多孢菌SP06081，10株融合菌的多殺菌素產(chǎn)量有所提高(表2)，其中一株菌株B-2多殺菌素產(chǎn)量增加最高，達(dá)453.4mg/L，較原始菌株刺糖多孢菌SP06081產(chǎn)量(105.2mg/L)提高了331%。

2.6 質(zhì)譜分析融合菌株所產(chǎn)多殺菌素

收集融合菌株B-2發(fā)酵液HPLC出峰時(shí)間近似多殺菌素A和D的峰液，進(jìn)行質(zhì)譜分析。正如Schwedler等[31]先前報(bào)道的，這兩種成分的m/z比率是732[M+H]+和746[M+H]+(圖9)。因此，這兩種成分分別確定為多殺菌素A和多殺菌素D。

2.7 融合菌株的遺傳穩(wěn)定性

將融合菌株B-2在YMG平板上傳5代，并檢測(cè)每代的多殺菌素產(chǎn)量，每代的多殺菌素產(chǎn)量與起始菌株B-2的產(chǎn)量接近，表明得到的高產(chǎn)融合菌株B-2是遺傳穩(wěn)定的。

表2 再次篩選融合菌株多殺菌素產(chǎn)量結(jié)果Tab.2 Spinosad production of protoplast fusion recombinants from the second screening

圖9 融合菌株發(fā)酵所產(chǎn)多殺菌素A和D的質(zhì)譜分析Fig.9 Mass spectrometry analysis of spinosyns A and D produced by fermentation of fused strains

3 討論

由于紅色糖多孢菌所產(chǎn)紅霉素可能對(duì)刺糖多孢菌具有殺傷作用，并且在融合菌株的生物代謝過(guò)程中，它的生物合成可能競(jìng)爭(zhēng)性地消耗多殺菌素合成所需要的原料和能量。因此先構(gòu)建了不產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌菌株，然后將其與刺糖多孢菌做原生質(zhì)體融合。

在再生平板培養(yǎng)基上，不產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌D菌株產(chǎn)色素的量較野生型菌株紅色糖多孢菌多，并且在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d后培養(yǎng)基顏色更深。究竟紅色糖多孢菌D不產(chǎn)生紅霉素后其胞內(nèi)代謝產(chǎn)生了怎樣的變化有待進(jìn)一步研究。

重組紅色糖多孢菌D和刺糖多孢菌經(jīng)原生質(zhì)體融合后大致有3種情況：①兩株刺糖多孢菌的融合菌；②兩株紅色糖多孢菌的融合菌；③刺糖多孢菌和紅色糖多孢菌的融合菌。因融合起始母本菌株紅色糖多孢菌D含有阿泊拉霉素(apramycin)抗性基因，而刺糖多孢菌對(duì)阿泊拉霉素敏感，所以經(jīng)含有阿泊拉霉素的平板培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選之后的菌落可確定為未融合的紅色糖多孢菌、兩株紅色糖多孢菌的融合菌及刺糖多孢菌和紅色糖多孢菌的融合菌。挑單菌落發(fā)酵后取其發(fā)酵液HPLC檢測(cè)，能夠產(chǎn)生多殺菌素的菌株即可確定為目的菌株—刺糖多孢菌和紅色糖多孢菌的融合菌。將融合菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液HPLC目標(biāo)峰液做進(jìn)一步質(zhì)譜分析，起到了輔證的作用。

本研究中，初次篩選到的4株融合菌的產(chǎn)量都不及原始菌株高，推測(cè)有以下幾個(gè)原因：①出發(fā)菌株都是產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物能力偏低的野生型菌株，其利用底物、次級(jí)代謝能力都不強(qiáng)，可能嚴(yán)重制約了融合菌產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝能力。文獻(xiàn)報(bào)道的高產(chǎn)多殺菌素融合菌株的獲得普遍采用的是產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物能力強(qiáng)的高產(chǎn)出發(fā)菌株[26-27]。②含有阿泊拉霉素的再生平板培養(yǎng)基可能對(duì)融合菌株具有較強(qiáng)的殺傷作用，不利于融合菌株的生長(zhǎng)，影響了高產(chǎn)多殺菌素融合菌株的篩選。在本研究中，先將原生質(zhì)體融合操作后的原生質(zhì)體稀釋液涂布在不含有阿泊拉霉素的再生平板培養(yǎng)基上，16～20h后再涂布適宜濃度的阿泊拉霉素進(jìn)行融合菌株的抗性篩選。在《鏈霉素操作手冊(cè)》中，Kesier等[30]曾提到原生質(zhì)體融合后直接將融合菌株涂布在含有抗生素的平板上培養(yǎng)可能會(huì)對(duì)融合菌株產(chǎn)生較強(qiáng)的殺傷作用。

基于以上分析，本研究改進(jìn)了篩選方法，進(jìn)行了第二次高產(chǎn)多殺菌素菌株篩選工作。本次篩選采用非抗生素篩選的方法，直接篩選再生平板培養(yǎng)基上菌落形態(tài)近似刺糖多孢菌的菌株，成功獲得若干多殺菌素產(chǎn)量增加的菌株，其中B-2菌株產(chǎn)量增加最為明顯，較原始菌株刺糖多孢菌SP06081提高了331%。比起傳統(tǒng)的理化誘變菌株改良方法，該方法效果明顯，再次證明原生質(zhì)體融合在改進(jìn)多殺菌素產(chǎn)量上是有效的。

Matsushima等[32-33]于1994年就建立了對(duì)刺糖多孢菌進(jìn)行遺傳基因轉(zhuǎn)移操作的兩種方法：一種是體外修飾后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體法；另外一種是大腸埃希菌與其接合轉(zhuǎn)移法，但這兩種操作方法復(fù)雜，并且轉(zhuǎn)化效率低下。該菌株的限制修飾系統(tǒng)成為對(duì)其進(jìn)行遺傳操作的技術(shù)難題，使得不少學(xué)者考慮將多殺菌素生物合成基因簇異源表達(dá)[17-18]。最近，已有探索對(duì)該菌株進(jìn)行基因遺傳修飾系統(tǒng)改進(jìn)的報(bào)道。如張求學(xué)等[34]摸索了在菌體培養(yǎng)48h至對(duì)數(shù)中期制備的感受態(tài)，在電場(chǎng)強(qiáng)度為12kV/cm，最小DNA濃度為0.1μg時(shí)可獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。本文研究即是對(duì)刺糖多孢菌進(jìn)行遺傳改良研究的一次有力補(bǔ)充。

本文對(duì)紅色糖多孢菌和刺糖多孢菌原生質(zhì)體融合進(jìn)行了研究并且成功提高了多殺菌素的產(chǎn)量，這為具有優(yōu)良發(fā)酵特性且高產(chǎn)多殺菌素的紅色糖多孢菌和刺糖多孢菌融合菌株的構(gòu)建提供了重要基礎(chǔ)。在后續(xù)工作中，將考慮選擇工業(yè)上使用的高產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌工程菌株與經(jīng)誘變育種篩選到的高產(chǎn)多殺菌素的刺糖多孢菌菌株作為融合起始菌株，擴(kuò)大供篩選菌落的總量，做多輪原生質(zhì)體融合以及優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，可能有助于進(jìn)一步提高融合菌株的多殺菌素的產(chǎn)量。此外，部分融合菌株可能會(huì)有一些新的發(fā)酵有益特性，如阿維鏈霉菌和刺糖多孢菌的融合菌株對(duì)發(fā)酵條件有較強(qiáng)的耐受性及利用淀粉作為發(fā)酵唯一碳源的特性。