王晨 李東偉 崔晨輝 王晶,* 王彥廣

(1 浙江大學(xué)，杭州 310027；2 浙江華方藥業(yè)股份有限公司，臺州 318020)

頭孢妥侖匹酯是日本明治制果株式會社研發(fā)的第四代口服頭孢菌素[1]，于1994年4月在日本上市，2001年4月在中國上市，商品名為美愛克(Meiact)。頭孢妥侖對革蘭陽性菌及革蘭陰性菌具有廣泛而強大的抗菌作用，對臨床主要感染病菌的體外活性要優(yōu)于頭孢地尼和頭孢呋辛，具有抗菌譜寬、臨床療效確切，安全穩(wěn)定，口服吸收好、血藥濃度高、體內(nèi)分布廣等特點，臨床應(yīng)用廣泛[2-4]。

頭孢妥侖匹酯已經(jīng)收錄于日本藥典(JP)17[5]和韓國藥典第十版[6]，但是并沒有對其殘留溶劑進(jìn)行規(guī)定，中國藥典2015年版也沒有對頭孢妥侖匹酯進(jìn)行規(guī)定。在頭孢妥侖匹酯的生產(chǎn)工藝中主要使用了二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、DMF等多種有機溶劑[4,7-9]，根據(jù)中國藥典的要求—“如生產(chǎn)過程中引入或產(chǎn)品中殘留有機溶劑，均應(yīng)按通則‘殘留溶劑測定法’檢查并應(yīng)符合相應(yīng)溶劑的限度規(guī)定”[10]，有必要對頭孢妥侖匹酯的的殘留溶劑進(jìn)行檢測。DMF在中國藥典和《殘留溶劑的指導(dǎo)原則》(ICH Q3C)中被定義為第二類溶劑，為應(yīng)限制使用，能導(dǎo)致動物非遺傳毒性致癌或可能導(dǎo)致其他不可逆毒性反應(yīng)的試劑，規(guī)定其限度為0.088%[11-12]。原料藥中DMF殘留量的檢測方法已經(jīng)有較多的研究和報道，主要運用氣相色譜法進(jìn)行檢測，由于DMF的沸點較高，基本采用直接進(jìn)樣的方式[13-16]，但目前尚未見頭孢妥侖匹酯中DMF殘留量檢測方法的報道。本文參考中國藥典2015年版通則0861殘留溶劑檢查法[11]和相關(guān)文獻(xiàn)[17-18]，建立了氣相色譜法測定頭孢妥侖匹酯中DMF殘留量的方法，該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏。

1 儀器與試藥

Agilent 7890B氣相色譜儀(美國Aglient公司)；ME204E電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

頭孢妥侖匹酯(浙江華方藥業(yè)股份有限公司提供，批號：180501、180502和180503)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，Merck，色譜純)；二甲基亞砜(DMSO，Honeywell，色譜純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-624(30m×0.53mm,3.0μm)；檢測器：FID；柱溫：程序升溫，初始柱溫110℃，保持5min，再以30℃/min的速率升至200℃，保持5min；進(jìn)樣口溫度：230℃；檢測器溫度：250℃；載氣：N2；載氣流速：3.0mL/min；進(jìn)樣體積：1.0μL；分流比：2:1。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取DMF 44.4mg，置于100mL量瓶中，用DMSO稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液；精密量取對照品儲備液5mL，置于50mL量瓶中，加DMSO至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品液的配制

取供試品500.0mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，加DMSO使其溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 供試品和對照品混合溶液的配制

取供試品500.0mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，加對照品溶液使其溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品和對照品混合溶液。

2.3 專屬性考察

取對照品溶液、供試品溶液、供試品和對照品混合溶液以及空白溶劑DMSO分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶劑對供試品測定無干擾，各色譜峰之間的分離度均大于1.5，各組分分離良好，供試品中其他組分對測定結(jié)果不影響，方法專屬性好，色譜圖見圖1。

2.4 檢測限和定量限的測定

取對照品溶液，逐步稀釋至相關(guān)濃度，使DMF的信噪比(S/N)為3.0時，即為DMF的檢測限，濃度為0.777μg/mL，換算樣品濃度后為0.002%；使DMF的信噪比約為10.0時，即為DMF的定量限，濃度為2.664μg/mL，換算樣品濃度后為0.005%。取定量限溶液，連續(xù)直接進(jìn)樣6針，峰面積RSD為0.47%，符合要求，色譜圖見圖2。

圖1 專屬性考察色譜圖Fig.1 Chromatograms of specificity test

2.5 線性與范圍試驗

精密量取對照品儲備液0.5、2.5、4.0、5.0、6.00和7.5mL，分別置于50mL量瓶中，加DMSO稀釋，配制成10%、50%、80%、100%、120%和150%濃度的溶液，搖勻，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=1.1867X+0.77739，r=0.9993，表明DMF濃度在4.44～66.60μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好，結(jié)果見表1和圖3。

2.6 準(zhǔn)確度(回收率)試驗

圖2 定量限測定色譜圖Fig.2 Chromatograms of the limit of quantitation

表1 線性試驗結(jié)果Tab.1 Linear test result

圖3 DMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of DMF

精密量取對照品儲備液0.8、1.0和1.2mL，分別置于10mL量瓶中(約相當(dāng)于限度的80%、100%和120%)，加入已測定DMF殘留量的供試品(180503，未檢出)約500.0mg，精密稱定，用DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為回收率測試液，每個濃度配制3份，直接進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算DMF的量、回收率，平均回收率和RSD，結(jié)果見表2。表明DMF的回收率都在95%～105%，平均回收率為100.72%，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.76%，符合要求。

2.7 精密度(重復(fù)性)試驗

按對照品溶液的配制方法配制對照品溶液，進(jìn)樣測定分析，平行操作6次，結(jié)果DMF峰面積的RSD為1.09%(n=6)，表明該方法精密度良好，結(jié)果見表3。

2.8 耐用性考察

在其他條件不變的情況下，考察了流速為2.8和3.2mL/min，起始柱溫為105和115℃，更換同一型號不同編號的色譜柱時，測試結(jié)果的變化。結(jié)果表明，在以上條件下，獲得的色譜圖中各溶劑峰理論塔板數(shù)均大于5000，各色譜峰之間的分離度均大于1.5，對照品溶液中DMF峰面積RSD均符合規(guī)定，方法耐用性良好，結(jié)果見表4。

2.9 樣品的測定

按供試品溶液的配制方法配制供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法計算樣品中DMF的殘留量，結(jié)果見表5。

3 討論

表2 DMF回收率數(shù)據(jù)Tab.2 Results of recovery test of DMF

表3 精密度試驗數(shù)據(jù)Tab.3 Results of precision test

表4 耐用性試驗結(jié)果Tab.4 Results of durability test

表5 樣品檢測結(jié)果Tab.5 Results of sample analysis

3.1 色譜柱的選擇

頭孢妥侖匹酯在生產(chǎn)中曾使用二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、DMF等多種有機溶劑，在選擇色譜柱時重點考察了拖尾因子，排除其他溶劑對測定的干擾。實驗中先后嘗試了HP-5和DB-1毛細(xì)管柱，發(fā)現(xiàn)拖尾因子均大于3，拖尾嚴(yán)重。使用DB-624色譜柱時，DMF峰形明顯改善，其理論塔板數(shù)和拖尾因子都好于前兩種色譜柱，符合要求。而且二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和乙醇等有機溶劑對測定無影響，適用于檢測DMF的殘留量。

3.2 溶劑的選擇

頭孢妥侖匹酯不溶于水，溶于DMF、N,N-二甲基乙酰胺和二甲亞砜，因測定DMF殘留，不能使用DMF作溶劑。采用N,N-二甲基乙酰胺作溶劑時，由于N,N-二甲基乙酰胺中含有DMF，同樣會對測定有干擾。因此，選擇二甲亞砜作為溶劑。

3.3 柱溫的選擇

本方法采用程序升溫，首先以初始柱溫110℃保持5min，再以30℃/min的速率升至200℃保持5min，可以縮短測定時間，較快除去殘留溶劑，避免影響后續(xù)樣品的測定。