陸凡 武紅麗 沙鳳 曹祁 陳姣 曹飛 韋萍

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京 211816)

自抗生素被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于醫(yī)學領(lǐng)域后，許多感染性疾病得到了有效控制，新生兒死亡率及手術(shù)后感染率大大降低，因此延長了人類生存的平均壽命。然而，細菌的耐藥性也隨之產(chǎn)生，人類的健康和生命安全又面臨新的考驗[1]。當前，面對日趨嚴峻的“抗菌”形勢，一些國家已經(jīng)開始采取激勵措施，鼓勵新抗生素的研發(fā)。美國于2012年7月通過了《鼓勵開發(fā)抗生素法案》(GAIN)，根據(jù)規(guī)定，符合標準的抗生素藥物將獲得額外5年的市場獨占權(quán)，以幫助開發(fā)者收回投資。然而新抗生素的開發(fā)難度越來越大，因此通過復方抗生素來提升治療效果也是解決細菌耐藥性的途徑之一[2]。

β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦(2)本身幾乎不具有抗菌活性[3]，但其抑酶譜廣，與其他抗生素聯(lián)用可有效恢復或增強其活性。2015年2月，由阿特維斯與阿斯利康聯(lián)合研發(fā)的阿維巴坦與頭孢他啶組成的復方藥物avycaz獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市，用于治療成人復雜性腹腔內(nèi)感染及復雜性尿路感染等系列疾病[4-5]。阿維巴坦屬于DBOs類化合物，化學名為[(1R,2S,5R)-2-(氨基羰基)-7-氧代-1,6-二氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛-6-基]硫酸單酯。其合成路線非常繁多，起始原料大致可分為L-焦谷氨酸衍生物、手性的哌啶環(huán)衍生物等，而以L-焦谷氨酸衍生物為起始原料的合成路線大都需要經(jīng)歷開環(huán)后增碳再閉環(huán)形成哌啶環(huán)衍生物的步驟[6]。因此，人們開始研究直接以手性的哌啶環(huán)衍生物為原料的合成路線。2014年，默克公司的一個研發(fā)小組報道了以手性哌啶環(huán)衍生物順式-5-羥基哌啶-2-甲酸(cis-5-hydroxy-L-pipecolic acids,cis-5-hypip,1)為原料，合成同樣具有二氮雜二環(huán)辛烷基本骨架的化合物，總收率高達39%，且該工藝路線具有公斤級放大規(guī)模的潛力[7]。而從化學結(jié)構(gòu)上來看，阿維巴坦具有兩個手性中心，這兩個手性中心都在哌啶環(huán)上，因此以cis-5-hypip作起始原料，則可較好地解決手性光學純度問題(圖1)。cis-5-hypip同樣也是TNF-α轉(zhuǎn)化酶抑制劑[8]合成的重要中間體。其本身也對導致存儲谷物腐敗的曲霉菌具有抑制作用[9]。目前，對cis-5-hypip合成的研究，主要分為化學合成和酶促合成兩個方面。

圖1 cis-5-hypip(1)與阿維巴坦(2)Fig.1 cis-5-hypip(1)and avibactam(2)

1 化學合成cis-5-hypip

Bailey等[10-11]以谷氨酰胺(3)為原料，將其轉(zhuǎn)化為N-芐氧基羰基甲酯(4)后，用亞硝酸叔丁酯作為[NO]+的來源并在乙腈中進行處理，使其側(cè)鏈酰胺基團選擇性水解的同時沒有水解酯或氨基甲酸酯，從而得到光學純的N-芐氧基羰基-L-谷氨酸-α-甲基酯(5)(Z-Glu-OMe，Z=芐氧基羰基)(74%)。用氯甲酸乙酯處理(5)后與混合酸酐和重氮甲烷反應(yīng)生成重氮甲酮(6)(收率82%)，接著通過碳烯引入N-H鍵將(6)轉(zhuǎn)化為受保護的5-氧代哌啶酸(7)(75%)。最后用硼氫化鈉立體特異性還原得到cis-5-hypip衍生物(8)(93%)，脫保護，得到最終產(chǎn)物(1)(圖2)，總收率為42%。但是該方法有使用工業(yè)上難以使用的重氮甲烷的工序，因此難以工業(yè)化，還存在所得到的化合物為立體異構(gòu)體的混合物的問題。

Krishnamurthy等[12]以具有叔丁氧基羰基(Boc)保護的丙二酸二乙酯(9)為原料，在乙醇鈉中用過量的4-溴-1-丁烯處理(9)，得到烷基化二酯，接著用固體LiOH選擇性皂化，得到半酸半酯，在回流甲苯中脫羧，得到(RS)-10(相對于9的總收率為59%)。用α-胰凝乳蛋白酶處理后得到純的對映體2-氨基-5-己烯酸衍生物(R)-10(51%)、(S)-11(46%)。在Et3N中用乙基溴將(S)-11酯化，得到(S)-10，產(chǎn)率84%。接著用過量的m-CPBA進行一系列處理得到環(huán)氧化物(12)(產(chǎn)率為90%)。再將非對映異構(gòu)環(huán)氧化物(12)分離得到手性二醇(2S,5S)-13和手性環(huán)氧化物(2S,5R)-12，收率分別為46%和47%。其中手性環(huán)氧化物(2S,5R)-12經(jīng)過6步反應(yīng)最終可以得到反式-5-羥基哌啶-2-甲酸。而手性二醇(2S,5S)-13在催化劑的作用下用TsCl處理二醇的選擇性甲苯磺?；玫絾渭妆交酋；a(chǎn)物(14)。使用NaI將(14)中的甲苯磺?；鶊F用碘基團取代，得到(2S,5S)-15(95%)。接著除去Boc基團使分子內(nèi)環(huán)化后用Boc基團再次重新保護氨基酸的氮，得到(2S,5S)-16(76%)，最后將其轉(zhuǎn)化為(1)(圖3)。該方法需要兩次分離非對映異構(gòu)體，每次分離都只能有一半的收率，導致最終總收率更低(7%)，且分離步驟較復雜，很難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

圖2 cis-5-hypip的化學合成路線一[11]Fig.2 Chemical synthetic route of cis-5-hypip[11]

2016年，竹原潤等[13]以(3S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(17)為原料，先將羥基進行保護得到(18)，接著將(18)中的酯基還原從而合成(3S)-4-氯-3-(四氫吡喃-2-基氧基)-丁烷-1-醇(P=四氫吡喃基)(19)，對它的羥基進行磺酸酯化從而得到(3S)-甲磺酸-4-氯-3-(四氫吡喃-2-基氧基)-丁酯(20)，將其與乙?；被岫阴?21)反應(yīng)后得到(22)，環(huán)化，脫保護，得到(5S)-1-乙酰基-5-羥基-哌啶-2,2-二甲酸二乙酯(24)。接下來將(24)中的酯基水解，通過使一個羧基與羥基反應(yīng)而進行內(nèi)酯化，然后使羧基脫羧得到(26)；或者將酯基水解，通過將一個羧基脫羧而得到2位單羧酸的立體異構(gòu)體混合物(25)，接著使該立體異構(gòu)體混合物進行異構(gòu)化內(nèi)酯化得到(26)。最后將(26)中的內(nèi)酯水解，并使其中的酰胺鍵斷裂，從而得到順式-5-羥基哌啶-2-甲酸，總產(chǎn)率達到44.8%(圖4)。該方法避免了因立體異構(gòu)體拆分導致產(chǎn)物較大損失的問題，具備工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

2 酶促合成cis-5-hypip

由于化學合成需要分子內(nèi)環(huán)化生成哌啶環(huán)且需要復雜的手性拆分方法，因而導致較長的合成步驟，使得總產(chǎn)率較低。而酶具有高度選擇性和專一性的特征，因此，人們也開始研究通過生物法制備cis-5-hypip。不同于化學合成中需要進行分子內(nèi)環(huán)化形成哌啶環(huán)，生物法可以運用酶的立體和區(qū)域選擇性，直接在L-哌啶甲酸(L-pipecolic acid,L-Pip)的5位碳上進行羥基化，這其中的關(guān)鍵酶為哌啶甲酸羥化酶(pipecolic acid hydroxylases,PiHs)。2016年，Hibi等[14]發(fā)現(xiàn)了來自于Fusarium oxysporumc8D和Aspergillus nidulansFGSC中的兩種順式-4-哌啶甲酸羥化酶基因(FoPip4H和AnPip4H)，可以將L-Pip羥基化生成順式-4-羥基哌啶甲酸。2017年，Huttel等[15]從Streptomycessp.和Frankia alni中發(fā)現(xiàn)了兩種PiHs(GetF和PiFa)，但是這兩種酶只能對L-Pip的3位碳進行羥基化，5位羥基化的哌啶甲酸羥化酶至今還沒有被發(fā)現(xiàn)。而在之前的報道中，脯氨酸羥化酶(proline hydroxylases,PHs)具有較為寬廣的底物選擇性，可以催化L-Pip生成羥基哌啶甲酸[16-17]，如順式-4-脯氨酸羥化酶(cis-proline-4-hydroxylases,cis-P4H)可以將L-Pip羥基化生成cis-5-hypip。為了降低成本，人們又以L-賴氨酸(L-lysine,L-Lys)為原料，通過賴氨酸環(huán)化脫氨酶(lysine cyclodeaminase,LCD)生產(chǎn)L-Pip，最終形成了從L-Lys到L-Pip再到cis-5-hypip的合成過程(圖5)。

圖3 cis-5-hypip的化學合成路線二[12]Fig.3 Chemical synthetic route of cis-5-hypip[12]

圖4 cis-5-hypip的化學合成路線三[13]Fig.4 Chemical synthetic route of cis-5-hypip[13]

2.1 賴氨酸環(huán)化脫氨酶

L-哌啶甲酸也是合成許多重要藥物的手性中間體，如卡因類局麻藥物S-利多卡因、S-羅哌卡因、S-布比卡因、S-左布比卡因等[18]。目前，以L-Lys脫去α位氨基來實現(xiàn)脫氨環(huán)化反應(yīng)過程有3條，分別是①L-賴氨酸-α-氧化酶與Δ1-哌啶-2-甲酸酯(Δ1-piperideine-2-carboxylate,P2C)還原酶途徑；②L-賴氨酸-2-氨基轉(zhuǎn)移酶與P2C還原酶途徑；③L-賴氨酸環(huán)化脫氨酶途徑[19]。由于前兩種途徑都是先生成一個P2C中間產(chǎn)物后再由P2C還原酶催化生成L-PA，反應(yīng)需要兩種酶參與且需要分兩步完成，因此人們更加傾向于更高效，更簡便的賴氨酸脫氨環(huán)化酶途徑，其在NAD+的幫助下，可以直接將線性底物L-賴氨酸催化環(huán)化成為L-哌啶甲酸，相較其他途徑，更為簡便快捷[20]。

圖5 cis-5-hypip的生物合成過程Fig.5 Biosynthesis route of cis-5-hypip

賴氨酸環(huán)化脫氨酶(LCD)的發(fā)現(xiàn)要歸功于對著名的移植抗排異藥物雷帕霉素的研究[21]。Moluar等[22]在研究鏈霉菌中次級代謝產(chǎn)物雷帕霉素的合成過程時，通過同位素標記意外地發(fā)現(xiàn)雷帕霉素中的效價基團哌啶甲酰胺來源于初級代謝產(chǎn)物賴氨酸，他們通過基因挖掘技術(shù)，初步獲得了LCD的基礎(chǔ)信息。然而早期對于LCD的研究因為技術(shù)手段的匱乏而十分局限，甚至出現(xiàn)了誤解(認為LCD也可以催化D-賴氨酸產(chǎn)生D-哌啶甲酸)。2006年，Gatto等[23]對來源于Streptomyces hygroscopicus的賴氨酸環(huán)化脫氨酶的基因rapL的酶學性質(zhì)進行了全面的表征并成功的將rapL在大腸埃希菌中進行了異源表達，同時也對ShLCD的輔酶依賴性做了詳細的考察，在外源性NAD+存在下，初始速率提高8倍，他們將NAD+進行催化利用的過程被稱之為“復雜NAD+依賴型轉(zhuǎn)化”(complex NAD+-dependent transformation)，豐富了改造這類酶的經(jīng)驗和基礎(chǔ)。2018年，Ying等[24]對以來源于Streptomyces pristinaespiralis的賴氨酸環(huán)化脫氨酶SpLCD進行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選與優(yōu)化，通過X射線衍射法解析SpLCD及其與小分子配體復合物的三維晶體結(jié)構(gòu)。進而對SpLCD進行分子動力學模擬，并結(jié)合定點突變闡述SpLCD與底物的識別與轉(zhuǎn)運機制、產(chǎn)物的釋放機制，篩選出了組合突變株Val61-Val94-SpLCD，相比野生型SpLCD，其催化效率提高了1.81倍，并且解除了底物與產(chǎn)物抑制。隨后利用該組合突變株進行了全細胞催化合成L-Pip的研究，在單次底物上載量為50g/L，分批補料3次的條件下，使最終的L-Pip產(chǎn)物濃度達到了73.4g/L，展現(xiàn)了一定的實際應(yīng)用潛力。

2.2 脯氨酸羥化酶

由于目前尚未發(fā)現(xiàn)對L-Pip上5位碳進行羥基化的PiHs，而PHs具有羥基化L-Pip的能力，因此人們轉(zhuǎn)向?qū)Hs的利用與改造[17]。PHs屬于非血紅霉素Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸(α-KG)雙加氧酶家族，這些酶通過與Fe2+、α-KG和O2產(chǎn)生的高反應(yīng)性鐵基(FeIV=O)復合物將羥基引入底物上沒有反應(yīng)活性的碳，是具有高度的區(qū)域和立體選擇性的C-H催化反應(yīng)[25]，與NAD(P)H依賴性P450單加氧酶相反，它們的共底物α-KG價格便宜，因此不需要再生循環(huán)系統(tǒng)。根據(jù)不同的區(qū)域和立體選擇性，PHs可以分為4種類型：順式-3-、反式-3-、順式-4-和反式-4-脯氨酸羥化酶(cis-P3H、trans-P3H、cis-P4H和trans-P4H)，分別將L-Pip羥基化形成對應(yīng)的羥基哌啶甲酸(圖6)。

1996年，Lawrence等[26]成功從綠灰菌素生產(chǎn)者Streptomyces griseoviridusP8648中發(fā)現(xiàn)了第一個PHs：trans-P4H。Sankyo公司的科學家使用Heliocerus oryzae和Acrocylindrium oryzae生產(chǎn)順式-4-羥基脯氨酸，最大產(chǎn)量為30mg/L[27]。Mori等[28-29]使用高靈敏度的HPLC分析篩選了超過3000種放線菌菌株的脯氨酸羥化酶活性，找到了8株具有trans-P4H活性的菌株，還鑒定了4種具有cis-P3H活性的菌株，之后，Mori等[29-34]還對這些基因進行PCR擴增和克隆并構(gòu)建重組表達載體，以大腸埃希菌為宿主進行異源表達，為之后進一步對這類酶的研究打下了基礎(chǔ)。2009年，Hara等[35]報道了從Sinorhizobium meliloti和Mesorhizobium loti的基因組中鑒定出的cis-P4H，并將這些cis-P4H分別命名為SmP4H和M1P4H，但是這些酶在催化L-Pip生成羥基哌啶甲酸的過程中會產(chǎn)生出兩個區(qū)域異構(gòu)體cis-5-hypip和cis-3-hypip，為了選擇性地生產(chǎn)cis-5-hypip，他們對SmP4H進行了3輪定向進化并成功地創(chuàng)建了cis-P4H三重突變體V97F/V95W/E114G，大大增加了對cis-5-hypip的區(qū)域選擇性(圖7)，同時還提高了酶的催化活性，使cis-5-hypip的產(chǎn)量達到778mg/L[36]。Haibin等[37]同樣使用蛋白質(zhì)工程對SmP4H進行改造，但即使改變了SmP4H的基因，也會生產(chǎn)出約9%的cis-3-hypip。Keisuke等[38]報道了來自于Swgniliparus rugosus的cis-P4H(SrP4H)，其在將L-Pip羥基化生成cis-5-hypip的過程中，只生成2%的cis-3-hypip，但是這種酶的催化活性較低，產(chǎn)量只有50mg/L。Ryoma等[39]從Xwnorhabdus doucetiaeFRM16和Xwnorhabdus romaniistr.PR06-A中鑒定出兩種具有很高5位羥基化選擇性的PHs(XdP4H和XrP4H)，其中XdP4H只生產(chǎn)出0.17%的cis-3-hypip，同樣XrP4H也只生產(chǎn)1.75%的cis-3-hypip，但是這兩種酶同樣存在催化活性低的問題。洪浩等[40]篩選了現(xiàn)有的PHs序列的同源序列，篩選出一個來自于Kordia jejudonensis的序列，具有較強的催化活性，他們對該羥化酶的氨基酸序列進行了突變試驗，得到了多株具有更高5位選擇性的突變株，在催化過程中3位的異構(gòu)體只占到2%左右。

3 小結(jié)

圖6 PHs的類型[17]Fig.6 The different kind of PHs[17]

圖7 PHs的定向進化[36]Fig.7 Directed evolution of PHs[36]

隨著細菌耐藥性的問題越來越嚴重，阿維巴坦作為一個能與其他抗生素聯(lián)用并提升療效的廣譜抑酶制劑，必將會受到廣泛應(yīng)用。而對于其合成路線中的關(guān)鍵中間體cis-5-hypip的研究也將越受關(guān)注。相對于化學合成復雜的手性拆分，導致產(chǎn)率較低，生物方法更加直接與高效，但是目前生物催化也存在一些問題，如SpLCD在催化底物轉(zhuǎn)化過程中酶活力不斷下降，并逐漸開始產(chǎn)生副產(chǎn)物P2C，而PHs在催化過程中的催化活性和選擇性也不是很好，這些都是在工業(yè)化生產(chǎn)之前需要解決的問題。無論是酶促合成或化學合成的方法，都期待更多、更高效、更利于工業(yè)化生產(chǎn)的cis-5-hypip合成路線的問世。