蔣萱， 羅佳，張曉月，黃玉勝，夏蕾,余嫻，楊鎮(zhèn)洲

400010重慶,重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 腫瘤中心(蔣萱、張曉月、黃玉勝、夏蕾、余嫻、楊鎮(zhèn)洲)；400042重慶，陸軍特色醫(yī)學中心 腫瘤中心(羅佳)

肺癌在全世界范圍內的男性及女性中，均是發(fā)病率最高(11.6%)且死亡率最高的腫瘤(18.4%)[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的治療包括手術、化療、放療、靶向治療、免疫治療等。對于NSCLC患者需要采用局部及全身治療相結合的綜合治療。對于Ⅰ～Ⅱ及ⅢA-N1期患者，以手術為主的治療模式已形成廣泛共識[2]，對于cN2的NSCLC患者，誘導化療±放化療或手術均是可供選擇的方式[3]。對于放療患者，放射性肺損傷(radiation induced lung injury，RILI)仍是影響療效及損害患者生存質量的并發(fā)癥[4]。確定縱隔淋巴結(medistinal lymph node，MLN)轉移情況，不僅有助于制定治療方案，也能提高靶區(qū)勾畫的精確度，降低放射性肺損傷的發(fā)生。

近來的遺傳學研究表明，原發(fā)腫瘤的基因表達譜微陣列預測分析(prediction analysis of microarray， PAM)可以預測非小細胞肺癌患者的淋巴結轉移狀態(tài)，N0患者中，基因表達譜微陣列預測分析 (prediction analysis of microarray， PAM)陽性的患者較PAM陰性的患者生存期更短，提示PAM可能比影像學更能準確地判斷隱性淋巴結轉移[5-6]。此外，一項針對NSCLC的cDNA序列的研究表明，預測腺癌和鱗癌淋巴結轉移的基因截然不同[5]。這些研究揭示了差異表達基因(differentially expressed genen,DEG)對腫瘤相關生物學特性的預測功能及其與淋巴結轉移之間的關系。通過生物預測因子來確認MLN轉移狀態(tài)將會是個體化治療的一大重要進展。

為了探索表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)敏感突變的肺腺癌患者MLN轉移的生物預測因子，我們前期的研究選取了10例EGFR突變肺腺癌患者[5例縱隔淋巴結轉移(medistinal lymph node metastasis，MLNM)，5例無縱隔淋巴結轉移(non-medistinal lymph node metastasis， NMLNM)]的石蠟切片，通過二代測序及生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)EGFR高突變頻率與ErbB2基因擴增可能可以作為肺腺癌MLN轉移的預測因子(未發(fā)表)。

為了明確EGFR及ErbB2(表皮生長因子受體2)表達與EGFR突變的肺腺癌患者的MLNM的相關性，我們選取了通過手術確診為肺腺癌且接受了MLN切除的患者，對其原發(fā)病灶標本進行了蛋白表達及mRNA分析。

1 材料與方法

1.1 臨床病例資料

本回顧性研究選取2012～2018年間，在陸軍特色醫(yī)學中心進行原發(fā)病灶手術切除及MLN清掃,病理結果為腺癌的患者。通過突變擴增阻滯系統(tǒng) (amplification refractory mutation system,ARMS)法或二代基因測序 (next generation sequential，NGS)檢測患者表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)突變情況。

1.2 免疫組化

檢測肺部原發(fā)病灶EGFR以及ErbB2的表達。腫瘤組織在4%福爾馬林中固定，室溫過夜，脫水然后石蠟包埋。切片(RM2235，萊卡，德國)厚度4μm。實驗步驟如下：1)60℃烤箱烤片過夜；2)脫水及脫蠟；3)滴加一抗(中杉金橋 EGFR TA-801933，ErbB2 TA-505802)，4℃孵育過夜；4)清洗后滴加二抗(SAP-9100羊抗兔/鼠)，37℃孵育25min;5)清洗后DAB顯色；6)水洗終止染色，蘇木素復染；7)分化及固定；8)封片[7]。用顯微鏡觀察(10倍目鏡×10倍物鏡)依照細胞陽性著色程度(抗原含量)，可分為弱陽性(+)1分，中等陽性(++)2分，強陽性(+++)3分，依照陽性細胞數(shù)量可分為：弱陽性<25%記1分，中等陽性(25%～49%)記2分，強陽性≥50%記3分；兩者相乘<3者為陰性，評0分；≥4且<6者為弱陽性，評1分；≥6者為強陽性，評2分。至少隨機觀察5～10HPF，取其均值[8]。EGFR在細胞質及細胞膜上表達，光學顯微鏡下觀察為棕黃色顆粒，定位好，不擴散，細胞形態(tài)清晰且著色顯著高于背景色[9]。ErbB2表達位于細胞膜[10]。

1.3 PCR

1.3.1 RNA的提取 RNA逆轉錄試劑盒提取石蠟組織中的RNA(依照thermofish K1622試劑盒操作流程)。

1.3.2 Real Time-PCR 利用Primerbank設計引物，GAPDH序列上游5’-CTGGCTACACTGAGCACC-3’，下游5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG -3’，EGFR序列 上游5’-AGGCACGATAACAAGCTCAC-3’，下游5’-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3’，HER2序列上游5’- TGGCCTGTGCCCACTATAAG-3’，下游5’- AGGAGAGGTCAGGTTTCACAC-3’；運行條件：95℃ 預變性5min，95℃ 變性10s、60℃ 退火15s、72℃延伸、20s×44個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學分析

運用SPSS18.0軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行分析。EGFR和ErbB2免疫組化強度與MLN轉移率相關性采用卡方檢驗，必要時用Fisher確切概率法。有無MLN轉移兩組間其他連續(xù)變量如免疫組化評分、mRNA表達水平等比較采用Kruskal-Wallis檢驗。相關性采用Pearson相關性分析。所有檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 臨床數(shù)據(jù)

本研究共選取30例患者，其中男性12例，女性18例。Ⅰ期 15例，Ⅱ期 4例，Ⅲ期 11例[其中ⅢA期(N2)9例 ，ⅢB期2例 ] 。其中11例為MLNM，19例為 NMLNM。根據(jù)吸煙狀態(tài)將患者分為3類：從不吸煙組(≤100支/一生)，曾吸煙組(>100支/一生且已戒煙≥1年)及吸煙組(>100支/一生并且戒煙<1年)[11]。PS評分0分、1分各15例。所有患者通過ARMS法或NGS均檢測到EGFR基因突變。除分期外，其余基線數(shù)據(jù)在兩組中差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 入組患者的臨床基線數(shù)據(jù)

Table 1. Characteristics of Patients

VariableMLNM(n=11)n(%)NMLNM(n=19)n(%)χ2PAge(median)55600.332Gender0.0060.938 Male5(41.7)7(58.3) Female6(33.3)12(66.7)Cancer stage28.229<0.001 Ⅰ0(0)15(100) Ⅱ0(0)4(100) Ⅲ11(100)0(0) Ⅳ0(0)0(0)Smoking history2.5220.373 No8(38.1)13(61.9) Yes (quited)2(25.0)6(75.0) Yes1(10.0)0(0)PS score0.1440.705 05(33.3)10(66.7) 16(40.0)9(60.0)

MLNM: Medistinal lymph node metastasis; NMLNM: Non-medistinal lymph node metastasis; PS: Performance status.

2.2 EGFR、ErbB2的蛋白表達與縱隔淋巴結轉移的關系

在NMLNM的19名患者中，EGFR陰性表達占13例(68.42%)，弱陽性表達占6例(31.58%)，無強陽性表達的病例；在MLNM的11名患者中，7例(63.64%)EGFR陰性表達，1例(9.09%)EGFR弱陽性表達，3例(27.27%)EGFR強陽性表達，EGFR在兩組中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.048)，其中，MLNM組中EGFG強陽性表達率高于NMLNM組，差異有統(tǒng)計學意義 (P=0.041)。在NMLNM的19名患者中，17例(89.47%)ErbB2陰性表達，弱陽性表達和強陽性表達分別為1例(分別為5.26%)，在11例MLNM患者中，4例(36.36%)ErbB2陰性表達，6例(54.55%)弱陽性表達，1例(9.09%)強陽性表達，ErbB2的表達在兩組間存在差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，MLNM組中ErbB2陽性表達率高于NMLNM組，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.001)(表2)。EGFR、ErbB2代表性表達情況見圖1。

圖1 EGFR、ErbB2蛋白在EGFR突變的肺腺癌中的表達情況(10×40)：

Figure1.ProteinExpressionofEGFRandErbB2inEGFR-MutatedLungAdenocarcinoma(10×40)

Panel A and B show the high expression of EGFR and ErbB2 in primary lesion (as indicated by the arrow); Panel C and D show the low expression of EGFR and ErbB2 in primary lesion (as indicated by the arrow); Panel E and F show the negative expression of EGFR and ErbB2 in primary lesion.

表2 EGFR、ErbB2蛋白表達與縱隔淋巴結轉移之間的關系

Table 2. Correlation between Protein Expression of EGFR or ErbB2 and MLNM

VariableEGFR (%)χ2PErbB2 (%)χ2PIHC scoreNegativeWeaklypositiveHighly positiveNegativeWeaklypositiveHighlypositiveNMLNM(n=19)13(68.42)6(31.58)05.8290.04817(89.47)1(5.26)1(5.26)9.9220.002MLNM(n=11)7(63.64)1(9.09)3(27.27)4(36.36)6(54.55)1(9.09)IHC scoreNegative+Weakly positiveHighly positiveNegativePositiveNMLNM(n=19)19(100)06.6140.04117(89.47)2(10.52)12.539<0.001MLNM(n=11)8(72.73)3(27.27)4(36.36)7(63.64)

EGFR:Epidermal growth factor receptor; MLNM:Medistinal lymph node metastasis; IHC:Immunohistochemistry; NMLNM:Non-medistinal lymph node metastasis.

2.3 EGFR、ErbB2 PCR表達與縱隔淋巴結轉移的關系

EGFR及ErbB2 mRNA 擴增倍數(shù)在NMLNM組中表達均較MLNM組高，但兩者在NMLNM組與MLNM組中擴增倍數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.108, 0.510)(圖2)

圖2 EGFR、ErbB2在MLNM及NMLNM中的轉錄水平

Figure2.mRNALevelofEGFRandErbB2intheMLNMGroupandtheNMLNMGroup

MLNM:Medistinal lymph node metastasis; NMLNM:Non-medistinal lymph node metastasis.

2.4 EGFR與ErbB2之間的相關性

EGFR蛋白與ErbB2蛋白表達之間存在相關性(r=0.975)，EGFR mRNA與ErbB2 mRNA擴增水平之間相關性較強(r=0.521)(表3)

表3 EGFR與ErbB2之間的相關性

Table 3. Correlation between EGFR and ErbB2

R (P)EGFR ErbB2EGFR mRNAErbB2 mRNAEGFR10.521 (0.003)-0.279 (0.135)-0.244 (0.193)ErbB20.521 (0.003)1-0.308 (0.097)-0.230 (0.222)EGFR mRNA-0.279 (0.135)-0.308 (0.097)10.975 (<0.001)ErbB2 mRNA-0.244 (0.193)-0.230 (0.222)0.975 (<0.001)1

EGFR:Epidermal growth factor receptor.

3 討 論

放療在N2及局部晚期NSCLC患者治療中扮演著重要的角色[12]，放射性肺損傷是其常見的副反應，其發(fā)生與肺受照射體積等相關[13]。對于MLN是否轉移及轉移模式的評判不僅有助于治療方案的制定，也對準確靶區(qū)勾畫、減少放射性肺炎的發(fā)生、提高局控率及總生存率具有重要意義[14-15]。影像學檢查是評估肺癌TMN分期的主要手段，而CT檢查是評估縱膈淋巴結轉移的主要非侵入方式。隨著影像學的發(fā)展，越來越多的其他影像學手段也被用來評估淋巴結轉移。一項針對122例非小細胞肺癌患者術前進行PET/CT及增強CT掃描對MLNM的前瞻性研究表明，PET/CT診斷MLNM的敏感性、特異性(分別為86%、85%)均顯著高于CT(分別為69%、71%)，但對于NSCLC患者，直徑小于10mm的伴有微小腫瘤侵犯的局部淋巴結，或者直徑超過10mm的伴有增生或者其他炎性良性病變的局部淋巴結仍是PET/CT及增強CT的盲區(qū)[16]。彌散加權成像(DWI)可以在細胞學水平，通過表觀擴散系數(shù)(ADC)來探測水分子在組織中受限擴散，近年來，被用于易于產生運動偽影的部位，例如縱隔。研究發(fā)現(xiàn)，DWI對于MLN檢測與PET/CT相比，有助于淋巴結轉移的診斷，但其假陰性結果仍影響其準確性[17]。而運用生物標志物預測淋巴結轉移狀態(tài)的研究早在90年代就已開始，雖然意大利科學家通過利用CEA與CT比較發(fā)現(xiàn)，前者對診斷MLNM的特異性與敏感性均無優(yōu)勢，但是隨著分子水平標志物的推廣，cDNA序列技術檢測基因表達的效率提高，使得通過cDNA從雜亂無章的序列中篩選出有診斷價值的信息成為可能[18]。我團隊致力于通過生物標志物預測MLN轉移狀態(tài)的研究，曾針對94例肺癌術后患者進行影像學及生物信息學研究，發(fā)現(xiàn)術前1月進行PET/CT及64排增強CT檢查，其對MLNM的敏感性、特異性、準確率及陽性預測率均不高，而通過差異表達基因 (differentially expressed gene， DEG)進行高內涵篩選 (high content screening，HCS)得出的增殖和轉移相關基因，可以作為影像學無法判斷MLN有無轉移時的補充[19]。而早在2004年，Takada等[5]已經從與鱗癌及腺癌都相關的1 289種基因中，發(fā)現(xiàn)了可以預測淋巴結轉移的與鱗癌相關的23種基因(MSH6、HIF1A、MLH1、MMP8等)及與腺癌相關的43種基因(IL10RA、MAPK10、TP53、XRCC3等)，其準確率分別為100%和94%。我國的多項研究也表明，Beclin1、MUC4mRNA、IGF2等多個基因的表達對MLNM有預測作用[20-22]。由此可見，隨著高通量測序的興起，利用表達譜尋找與腫瘤發(fā)生、轉移相關的基因，確定MLN轉移預測因子的研究正在大力推廣?；驒z測通過對MLN轉移狀態(tài)的推測，來確認患者淋巴結的轉移狀態(tài)，從而可能制定更合理的治療方案。

多個研究也報道EGFR強陽性表達可促進腫瘤增殖、血管生成、轉移等，尤其是在乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌等癌癥中，EGFR的強陽性表達與腫瘤轉移相關。在非小細胞肺癌中，研究報道EGFR可能與Ki-67發(fā)揮協(xié)同作用，對MLNM轉移產生影響[23]。另有報道發(fā)現(xiàn)：EGFR在原發(fā)灶中的表達在有淋巴結轉移患者中高于無淋巴結轉移的患者，這也體現(xiàn)了EGFR在腫瘤淋巴結轉移中的作用[24]。我團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，EGFR高突變頻率與ErbB2基因擴增可能可以作為肺腺癌MLN轉移的預測因子，在此基礎上，本研究進一步證實EGFR及ErbB2在蛋白水平陽性表達與NSCLC的MLN轉移呈正相關，原發(fā)灶中EGFR強陽性表達及ErbB2陽性表達可能對肺腺癌MLN轉移有預測作用(P值分別為0.041與<0.001)。

EGFR是第一個被發(fā)現(xiàn)其突變、過表達與腫瘤相關的基因家族，它共有四個結構相關因子，EGFR(HER1)、ErbB2(HER2/neu)，ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)，它們相互結合形成二聚體或異二聚體發(fā)揮作用，其中ErbB2不能結合EGFR的受體，因此不能形成二聚體，但兩者激酶催化區(qū)域具有高度同源性和相似的生化動力學特性，因此兩者的信號通路可以相互作用，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮協(xié)同作用；并且ErbB2基因的突變導致ErbB2胞外結構域缺失或者形成ErbB2/EGFR異二聚體，進而促進細胞增殖[25-26]。EGFR突變可以選擇性激活下游PI3K/Akt和JAK/STAT通路，抵抗腫瘤細胞凋亡。EGFR激活突變可以積累EGR-TKI結構域(TKD)，進一步選擇性激活下游信號通路導致EGFR表達上調，從而導致細胞增殖等。EGFR激活還可通過促進VEGF的釋放作用于腫瘤和內皮細胞，導致血管生成增加，促進腫瘤轉移[27-29]。而EGFR突變的肺腺癌患者接受EGFR-TKI或化療，預后均較野生型患者好，體現(xiàn)了EGFR突變情況對肺腺癌患者預后的預測價值[30]，而突變情況不能代替EGFR蛋白表達情況，因此，本研究對EGFR突變的肺腺癌原發(fā)灶中EGFR、ErbB2蛋白的表達與MLN轉移狀態(tài)之間的關系進行研究，發(fā)現(xiàn)EGFR強陽性表達及ErbB2陽性表達在蛋白水平與MLN轉移存在相關性，為EGFR、ErbB2作用生物信息學的靶點預測EGFR突變的肺腺癌縱隔淋巴結狀態(tài)提供了理論依據(jù)，鑒于本研究樣本數(shù)量，EGFR及ErbB2的敏感性和特異性還需大樣本進一步驗證。

通過相關研究我們推測，EGFR和ErbB2通過被配體激活，且持續(xù)介導下游信號通路傳導，使兩者在腫瘤發(fā)展及轉移中發(fā)揮協(xié)同作用。EGFR與ErbB2如何影響下游信號通路介導縱隔淋巴結轉移還有待進一步研究。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔相應責任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關規(guī)定保存，可接受核查。

學術不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(CNKI)科技期刊學術不端文獻檢測系統(tǒng)的學術不端檢測。

同行評議：經同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權書等協(xié)議。