黃環(huán)，張琴，肖何，王閣

400042 重慶，陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院 腫瘤中心

頭頸部鱗癌解剖位置復雜、病理類型多樣，是一組具有很強異質性的疾病。疾病會對患者的外貌、味覺、嗅覺等功能造成破壞，給患者造成嚴重的心理負擔，極大影響患者的生活質量。頭頸部鱗癌采取以手術、放療、化療及靶向治療等綜合治療方式，不幸的是約50%～60%的頭頸部鱗癌首次診斷時已是局部晚期或晚期，在這部分人群中靶向治療發(fā)揮著越來越重要的作用。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)在頭頸部鱗癌中高表達，且該受體的表達與預后相關，是頭頸部鱗癌的一個重要治療靶點?；趪H前瞻性III期隨機臨床實驗(EXTREME)[1]和中國人群的CHANGE-2研究，2019年《中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學協(xié)作專業(yè)委員會頭頸腫瘤診療指南》進行了更新，將復發(fā)轉移性頭頸部鱗癌西妥昔單抗聯(lián)合化療一線治療的2類證據(jù)級別更新為1A類證據(jù)。西妥昔單抗是一種EGFR單克隆抗體，此更新肯定了其在頭頸部鱗癌中的治療價值。然而，并不是所有頭頸部鱗癌患者均能從抗EGFR單抗如西妥昔單抗聯(lián)合化療獲益[2]，因此如何進一步篩選出更有效的獲益人群就成為了亟待解決的問題。

Lavin等[3]和Chevrier等[4]發(fā)表在《Cell》上的兩項研究表明，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞組成常常會決定其對某種特定療法的療效。由此，我們擬通過公共數(shù)據(jù)庫基因表達譜數(shù)據(jù)GSE65021(發(fā)現(xiàn)集)和GSE102995(驗證集)，在細胞亞群的特征基因中發(fā)現(xiàn)抗EGFR單抗治療敏感指標，構建頭頸部腫瘤對抗EGFR單抗療效的預測模型，為頭頸部腫瘤患者抗EGFR靶向治療提供預測性生物標志物提供線索。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集獲取和預處理

數(shù)據(jù)集GSE65021和GSE102995均從Gene Expression Omnibus(GEO)獲取。GSE65021包含40例接受一線鉑類聯(lián)合西妥昔單抗治療的晚期復發(fā)轉移性頭頸鱗癌患者。其中有14例和26例患者無進展生存時間(progression free survivid,PFS)時間分別大于12個月(LONG group)和小于5.6個月(SHORT group)[5]。GSE102995包含25例一線接受帕尼單抗治療復發(fā)轉移性晚期頭頸鱗癌PFS數(shù)據(jù)[6](表1-2)。兩個數(shù)據(jù)集均采用Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 expression beadchip微陣列芯片，共檢測29 377個探針表達值。采用R軟件包’annotate’將各微陣列探針I(yè)D號注釋到基因ENTREZID號上，對于多個探針對應一個基因，取四分位距最大探針代表該基因表達值。此外，過濾掉不能對應到ENTREZID上的探針值。兩個數(shù)據(jù)集共有19 434個重疊基因納入分析。從Isella等[7]的研究和Angelova等[8]的研究分別獲取腫瘤相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAF)和腫瘤浸潤淋巴細胞特異性表達基因列表。將這些細胞特異性表達基因符號轉化成ENTREZID，并剔除與GSE65021和GSE102995不重疊的基因，得到822個基因對應32個細胞亞群(表3)。

1.2 抗EGFR單抗敏感指數(shù)的建立

采用R軟件包”limma”分析GSE65021數(shù)據(jù)集LONG相對于SHORT組間差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)。表達倍量變化大于2倍并且FDR<0.05作為顯著DEGs。為進一步納入合適數(shù)量的基因構建模型，將2 179個未校正P<0.05 DEGs與32個細胞亞群特征表達基因重疊，篩選出同一個細胞亞群特征表達基因中高表達DEGs和低表達DEGs，各個細胞亞群特征基因數(shù)目和及其所屬的高表達和低表達基因數(shù)目見補充材料。在各個具有所屬的高表達基因和低表達基因的細胞亞群中，計算高表達基因表達均值與低表達基因均值比值，作為該細胞亞群的敏感指標。共有18個細胞亞群可計算敏感指標，涉及99個基因。利用最小絕對值收斂和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,LOSSA)算法篩選與LONG組顯著相關的細胞亞群指標。利用顯著細胞亞群指標歸回系數(shù)與對應敏感指數(shù)的乘積之和作為預測抗EGFR單抗敏感評分(anti-EGFR antibodies sensitive score,EASS)。

表1 所用數(shù)據(jù)集GSE65021的基線特征

Table 1. Baseline Characteristics of Datasets GSE65021 Used

VariableGSE65021 n(%)Gender Female31 (77.5) Male9 (22.5)Anatomy site of primary lesions Oral cavity19 (47.5) Oropharynx9 (22.5) Hypopharynx4 (10.0) Larynx8 (20.0)T stage T13 (7.5) T28 (20.0) T39 (22.5) T420 (50.0)Degree of differentiation Well2 (5.0) Moderately 20 (50.0) Poorly18 (45.0)Radiotherapy No6 (15.0) Yes34 (85.0)PFS Long14 (35.0) Short26 (65.0)Biospy site Primary tumour31 (77.5) Recurrence or metastasis9 (22.5)

PFS: Progression free survival.

1.3 EASS的驗證

在GSE102995數(shù)據(jù)集中同法計算18個細胞亞群可計算敏感指標和EASS。由于GSE102995數(shù)據(jù)集給出了每個患者的具體PFS時間和刪失情況，采用Cox回歸分析EASS與PFS的相關性，并對分期和體質評分進行校正。采用一致性指數(shù)(C-index)判斷臨床分期和EASS對PFS預后作用的準確性，并相互比較。

表2 所用數(shù)據(jù)集GSE102995的基線特征

Table 2. Baseline Characteristics of Datasets GSE102995 Used

VariableGSE102995 n(%)Performance status 014 (56.0) 111 (44.0)Stage II7 (28.0) III2 (8.0) IV9 (36.0) IVA6 (24.0) IVB1 (4.0)Biopsy site Primary tumour20 (80.0) Recurrence or metastasis5 (20.0)

1.4 統(tǒng)計學處理

18個細胞亞群敏感指數(shù)在LONG和SHORT組間比較采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗。熱圖采用R軟件包NMF(Version 0.21.0) ”aheatmap”函數(shù)完成，表達值以及聚類間相似性采用歐氏距離量度。主成分分析采用”FactoMineR”軟件包”PCA”和”fviz_pca_ind”函數(shù)完成。LASSO分析采用包”glmnet”完成。一致性指數(shù)及其95%置信區(qū)間以及一致性指數(shù)間比較采用軟件包”survcomp”完成。其它統(tǒng)計學方法和圖形均由SPSS 20.0完成，P<0.05定為有統(tǒng)計學意義，所有檢驗均為雙尾檢驗。

2 結 果

2.1 臨床病理學資料

為了篩選抗EGFR單抗治療敏感性基因標記物，我們對來源于GEO數(shù)據(jù)庫的使用抗EGFR單抗治療的轉移性頭頸部腫瘤轉錄組芯片GSE65021和GSE102995芯片數(shù)據(jù)進行了分析。兩個數(shù)據(jù)集納入病例基線臨床特征如表1所示。兩個數(shù)據(jù)集均納入了不同分期的頭頸部腫瘤患者，不同之處為GSE65021數(shù)據(jù)集納入患者使用的抗EGFR單抗為西妥昔單抗，而GSE102995數(shù)據(jù)集納入患者使用的為帕尼單抗。腫瘤對藥物治療的響應評估基于患者在經(jīng)抗EGFR單抗治療后PFS時間。在GSE65021文獻中，經(jīng)抗EGFR單抗治療后PFS時間大于12個月和小于5.6個月的患者分別定義為對抗EGFR單抗治療敏感型(LONG組)和抵抗型(SHORT組)。

2.2 EASS的構建及其對LONG組預測作用

在32個細胞亞群中，有18亞群可計算細胞亞群敏感指數(shù)。18個細胞亞群敏感指數(shù)在LONG組與SHORT組間分布均有顯著差異(表3,圖1)。對18個亞群敏感指標的主成分分析表明，前兩個主成分可將LONG與SHORT人群較好區(qū)分(圖2)。LASSO對18個敏感指數(shù)進行Logistic回歸，僅有9個細胞亞群納入模型(表2)。9個細胞亞群敏感指標值在LONG與SHORT組間差異熱圖見圖3。利用這9個細胞亞群回歸系數(shù)和對應敏感指標構建EASS，計算得到在全體40例人群中EASS中位值為30.73(26.24～41.29)。EASS值分布在LONG與SHORT組間有顯著差異(median: 35.02vs29.08, Kruskal-Wallis rank sum testP=2.459×10-7)。ROC曲線分析表明，EASS可完全區(qū)別LONG組人群與SHORT人群(AUC:1.000,95%CI:1.000～1.000,P<0.001)。

圖1 18個細胞亞群敏感指數(shù)在LONG和SHORT組間比較(P<0.01)

Figure1.DistributionandComparisonsof18CellSubpopulationsSensitiveIndexesBetweenLONGGroupandSHORTGroup(P<0.01)

表3 發(fā)現(xiàn)集中18個細胞亞群敏感指數(shù)和預測長PFS組LASSO算法回歸系數(shù)

Table 3. Sensitive Indices of 18 Cell Subpopulations in Discovery Set and Coefficients Deduced from LASSO Algorithm for Predicting Long Progression Free Survival Patients

Cell subpopulationLong median (IQR)Short median (IQR)P(Kruskal-Wallis)Coefficient (LASSO)T cells1.485 (1.367-1.528)1.208 (1.142-1.293)<0.001-CAF0.779 (0.721-0.856)0.628 (0.593-0.661)<0.0014.661pDC0.891 (0.866-0.908)0.830 (0.786-0.865)<0.001-MDSC1.317 (1.213-1.377)1.083 (1.027-1.209)<0.0013.114

Cell subpopulationLong median (IQR)Short median (IQR)P(Kruskal-Wallis)Coefficient (LASSO)Central memory CD40.751 (0.666-0.830)0.629 (0.568-0.692)0.003-Th11.208 (1.148-1.251)1.061 (0.897-1.141)0.001-Eosinophil2.096 (1.967-2.158)1.872 (1.666-1.969)0.002-Effector memory CD80.868 (0.814-0.939)0.734 (0.702-0.802)<0.001-Mast cells1.244 (1.167-1.314)0.982 (0.869-1.126)<0.001-Th21.771 (1.682-1.988)1.554 (1.461-1.697)0.0010.584iDC1.293 (1.161-1.432)1.101 (1.025-1.210)0.004-DC0.825 (0.715-0.899)0.616 (0.571-0.686)<0.001-Treg1.088 (1.033-1.189)0.880 (0.814-0.985)<0.0013.687NK56 dim1.111 (0.962-1.235)0.850 (0.731-0.931)<0.0016.054Macrophages0.906 (0.838-1.002)0.745 (0.660-0.784)<0.0010.797Immature B cells1.509 (1.438-1.582)1.321 (1.277-1.402)<0.0016.453Th171.080 (0.934-1.121)0.879 (0.795-0.959)0.0013.026TFH0.983 (0.906-1.046)0.808 (0.758-0.851)<0.0012.089EASS35.02 (34.41-36.05)29.08 (27.99-30.27)<0.001

EASS: Anti-EGFR antibodies sensitive score.

圖2 主成分分析表明18個細胞亞群敏感指數(shù)前兩個組成分可較好區(qū)別發(fā)現(xiàn)集LONG和SHORT組

Figure2.PrincipleComponentAnalysisShowingEfficientDiscriminationBetweenLONGGroupandSHORTGroupintheDiscoverySet

2.3 對EASS的驗證結果

在獨立驗證集GSE102995中，用與訓練集相同方法計算EASS。EASS中位值為35.70(31.997～39.100)，以中位值作為截斷值，高于中位值組為進展低風險組，低于中位值組為進展高風險組。高低風險組中位PFS時間分別為51天(95%CI:45.13～56.87)和166天(95%CI:57.37～274.63)(Log RankP=0.021)(圖4A)。而腫瘤臨床分期II～III與IV期患者間PFS無顯著差異(Log RankP=0.409)(圖4B)。EASS以連續(xù)變量Cox分析表明，進展風險隨EASS增加而降低(HR=0.647,95%CI:0.504～0.831,P=0.001)。對分期(IVvsII～III)和PS評分校正后，EASS依然是PFS的獨立預后因素(HR=0.647,95%CI:0.503～0.831,P=0.001)。EASS和分期對PFS預測準確性的C指數(shù)分別為0.755(95%CI:0.719～0.791,P=6.311)，0.542(95%CI:0.336～0.748,P=0.688)。兩個C指數(shù)間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.032)。

圖3 9個細胞亞群敏感指標值在LONG組與SHORT組的熱圖

Figure3.SensitiveIndexesof9CellSubpopulationsbetweenLONGGroupandSHORTGroup

圖4 Kaplan-Meier曲線表明EASS劃分低危和高危組間(A)以及臨床分期組間(B) PFS差異

Figure4.Kaplan-MeierCurvesShowingDifferencesinProgressionFreeSurvivalbetweenLowRiskGroupandHighRiskGroupDividedthroughAnti-EGFRAntibodiesSensitiveScore(A)andClinicalStage(B)

3 討 論

既往有多項研究探索了晚期頭頸部腫瘤對EGFR單抗治療敏感性的分子標記物。Licitra等[9]分別用熒光原位雜交和免疫組化的方法評價了EGFR拷貝數(shù)或表達水平對頭頸腫瘤對EGFR單抗敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)EGFR拷貝數(shù)和表達水平與頭頸部腫瘤的總生存時間、PFS以及對藥物的反應均無相關性。De Cecco等[10]通過全轉錄組測序篩選差異表達基因構建模型及頭頸部腫瘤的分子分型來預測頭頸部腫瘤對抗EGFR單抗治療的敏感性，并在多線治療后使用西妥昔單抗的晚期腸癌患者中驗證其模型的有效性，發(fā)現(xiàn)通過分子分型來預測頭頸部腫瘤的準確性為87.7%。

西妥昔單抗的抗腫瘤的主要作用包括阻斷EGFR依賴的生長信號、抗體介導的細胞毒性作用以及活化自噬基因，誘導腫瘤細胞自噬。目前還沒有研究分析免疫微環(huán)境對西妥昔單抗在頭頸部腫瘤中療效的影響。因此，我們構建基于免疫細胞亞群的頭頸部腫瘤抗EGFR單抗治療敏感性預測評分EASS。我們發(fā)現(xiàn)EASS不但可完全區(qū)別發(fā)現(xiàn)集LONG組人群與SHORT組人群，而且在驗證集中是PFS的獨立預后因素。本文中EASS在獨立驗證集中得到較好的預測效能主要歸因于如下兩點：一是在發(fā)現(xiàn)集DEGs篩選中使用了PFS極端值組別；二是在各個細胞亞群中使用了基因表達率的計算方法，該方法也被用于構建免疫預測指標的研究中[11]。

在納入到EASS計算的9個免疫細胞亞群中，CAF、髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)和Th2這3個細胞亞群可能發(fā)揮了更為重要的作用(表2)。CAF是腫瘤微環(huán)境中宿主細胞的主要成分。CAF具有很強的異質性，來源多種多樣，包括成纖維細胞、上皮細胞、間充質干細胞和骨髓來源的干細胞等[12]。CAF來源等異質性也部分決定其表型和功能等異質性。CAF的功能包括：促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移、胞外基質重塑、血管生成、上皮間質轉化以及腫瘤耐藥等[13]。在屬于CAF細胞亞群特征基因中，LONG組表現(xiàn)出DPT、COL8A1、PTN、PTGIS、DDR2、EFEMP1(fibulin-3)和EPHA3等基因表達水平下調，提示這些基因可能通過影響CAF功能進而調控頭頸鱗癌對抗EGFR單抗的敏感性。在一項乳腺癌的研究中[14]，間充質干細胞誘導的DDR2介導間質-乳腺癌的相互作用和轉移生長。此外，下調DDR2可降低肝癌的生長速度[15]。以上研究提示DDR2基因在腫瘤的生長和轉移中發(fā)揮著重要作用，而其表達下調可能對腫瘤控制有促進作用。Han等[16]在研究膀胱移形細胞癌時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ibulin-3表達水平與多個膀胱癌細胞株的侵襲能力相關。在小鼠原位膀胱癌模型中，下調fibulin-3降低了侵襲性膀胱癌的發(fā)生率。La Rocca等[17]發(fā)現(xiàn)沉默酪氨酸激酶EPHA3表達降低了多發(fā)性骨髓瘤細胞的體外黏附和侵襲以及體內生長和血管生成。

在腫瘤微環(huán)境中，MDSC是免疫抑制環(huán)境的主要宿主成分[18]，它們是一群具有免疫抑制功能的未成熟細胞，通過抑制效應T細胞和自然殺傷細胞等抗腫瘤免疫細胞的功能介導腫瘤免疫逃逸。Li等[19]通過注射可溶性FLT1可以抑制肝癌小鼠模型的腫瘤生長和延長生存期。而該基因在LONG組MDSC細胞中上調表達，提示FLT1參與調控DMSC功能促進抗EGFR單抗療效。

綜上所述，頭頸鱗癌腫瘤微環(huán)境免疫細胞對抗EGFR單抗療效可能具有重要影響。由于頭頸部鱗癌患者可能合并人乳頭瘤病毒(human papllomavirus,HPV)感染，在未來研究中應增加HPV感染的因素[20]，并進一步在大量臨床樣本中分析EASS對西妥昔單抗一線治療PFS的預測能力[21]。

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