常開霞 ，孫軍勇 ，李曉敏 ，吳殿輝 ，朱德偉 ，陸 健 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenases，ADH，EC1.1.1.1）是一類以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為輔酶、以鋅原子為輔基的二聚體酶，是乙醇代謝的關(guān)鍵酶[1]。人體中，乙醇脫氫酶可催化乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醛由乙醛脫氫酶繼續(xù)催化轉(zhuǎn)化為乙酸，乙酸經(jīng)過三羧酸循環(huán)途徑轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水排出體外[2]。目前，人體內(nèi)的乙醇脫氫酶有5大類：ADH I、ADH II、ADH III、ADH IV 和 ADH V， 其中 ADH IV 類由 δδ-ADH 組成，其亞基為 δ（或者 μ）[3-4]。 δδ-ADH是惟一不存在于肝臟的乙醇脫氫酶，它主要分布于胃粘膜細(xì)胞中[5]。

隨著社交需要和生活壓力的增大，一方面酒精飲品的消耗量不斷增加，另一方面人們對(duì)解酒保肝類物質(zhì)的需求日益迫切，因而用乙醇脫氫酶來研制解酒藥將成為一項(xiàng)重要的應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)[6]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于人乙醇脫氫酶的研究主要集中在肝臟中的 ADH I類[7-8]，其中 ADH1B*2、ADH1C*1 是 I類乙醇脫氫酶中活性最高的兩種形式[9]，它們也存在于胃粘膜或者胃肌肉細(xì)胞中[5]。實(shí)驗(yàn)證明[9]，當(dāng)乙醇濃度小于10 mmol/L時(shí)，ADH1B*2是各類人乙醇脫氫酶中活性最高的酶；但當(dāng)乙醇濃度大于10 mmol/L時(shí)，δδ-ADH的活性最高。飲酒后，胃中乙醇濃度可達(dá)摩爾級(jí)水平。研究指出[10]，當(dāng)每千克體重飲入0.8 g純乙醇時(shí)，胃腔中乙醇濃度可以達(dá)到1.5 mol/L。在飲酒后乙醇濃度較高的胃環(huán)境中，由于乙醇的底物抑制作用，ADH1B*2、ADH1C*1氧化乙醇的作用小于δδ-ADH，δδ-ADH很可能是人體內(nèi)氧化高濃度乙醇作用最大的一種酶[5，11]。

由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與其他表達(dá)系統(tǒng)相比具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、培養(yǎng)周期短、成本低，且目的基因有表達(dá)水平高、抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[12]，因此，作者利用大腸桿菌表達(dá)載體對(duì)δδ-ADH進(jìn)行外源表達(dá)并對(duì)該酶的最適作用溫度、最適pH、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及乙醇耐受性進(jìn)行研究，以期為δδ-ADH的進(jìn)一步研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 δδ-ADH的基因來源通過NCBI獲得δδ-ADH編碼基因ADH7的序列 （GenBank登錄號(hào)：L47166.1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，5’端和3’端分別預(yù)設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)BamHI和SalI。

1.1.2 質(zhì)粒及其他試劑質(zhì)粒pMD19T-simple、pET-32a（+）、E.coliJM109、E.coliBL21（DE3）：均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4連接酶、異丙基硫化-β-D-半乳糖苷（IPTG），DNA Marker、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) Marker：均購自大連寶生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑：均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建為了提高酶切效率，首先將ADH7與克隆載體pMD19T-simple連接，獲得重組質(zhì)粒pMD19T-ADH7。利用BamHI和SalI將pMD19T-ADH7和pET-32a（+）分別進(jìn)行雙酶切后，回收目的片段ADH7和pET-32a（+）質(zhì)粒片段，經(jīng)T4連接酶連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a（+）-ADH7，并通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21（DE3），將轉(zhuǎn)化液涂布在含氨芐青霉素（100 μg/L）的LB固體培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

菌落PCR反應(yīng)時(shí)，首先經(jīng)95℃預(yù)變性5 min，之后于94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，循環(huán)30次，然后在72℃延伸10 min。最后PCR產(chǎn)物用1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)[2]挑取含重組表達(dá)質(zhì)粒（pET-32a（+）-ADH7）及空質(zhì)粒（pET-32a（+））的陽性轉(zhuǎn)化子，分別接種于3 mL含100 μg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后按1%的接種體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD600值為0.6時(shí)加入IPTG （終濃度為1 mmol/L），并于37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.2.3 包涵體的制備與目的蛋白質(zhì)的純化

1）包涵體的制備[13-14]：菌液離心后去上清液，用破胞液 （50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0）重懸菌體并將其冰浴超聲破碎 14 min（超聲 3 s，間隔 6 s，功率 350 W），8 000 r/min、4℃下離心15 min，收獲粗包涵體沉淀。沉淀經(jīng)包涵體洗滌液 （50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，2 mol/L尿素 ，0.5%Triton X-100，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）沖洗一次，再經(jīng)水洗一次后于8 000 r/min、4℃下離心15 min，收獲的沉淀即為純化的δδ-ADH包涵體，并利用含低濃度尿素的溶解液溶解包涵體，離心取上清液獲得含有重組目的蛋白質(zhì)的粗酶液。

2）目的蛋白質(zhì)的純化：載體 pET-32a（+）中含有S tag，His tag以及Trx tag三種標(biāo)簽（共18 000）。作者以His tag為純化標(biāo)簽，選用1 mL HisTrapTMexcel親和色譜柱對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。上樣前首先用結(jié)合液 （500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.4）平衡鎳柱，上樣量10 mL，上樣流速為0.5 mL/min。再用5倍柱體積的結(jié)合液沖洗，最后用15倍柱體積的洗脫緩沖液 （500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.4）線性梯度洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)，洗脫流速為1 mL/min。上樣后開始收集流出液（每管收集1 mL），并通過SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)分離效果。

1.2.4 乙醇脫氫酶活性檢測(cè)ADH催化乙醇脫氫生成乙醛的同時(shí)，NAD+被還原成NADH，鑒于NAD+和NADH分別在260 nm及340 nm處有各自的最大吸收峰，因此測(cè)定340 nm處吸光度的增加值可反映ADH的活性[2]。

乙醇脫氫酶δδ-ADH的酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]中的方法并稍作修改，酶活測(cè)定前，先將一定體積的 0.1 mol/L 甘氨酸/NaOH（pH10.0）緩沖液、NAD+及乙醇溶液于25℃溫浴5 min，以確保反應(yīng)開始時(shí)混合液即達(dá)到所需溫度。然后向混合液中加入酶液，于25℃反應(yīng)5 min，沸水浴終止反應(yīng)并用分光光度計(jì)在340 nm測(cè)定吸光值，見表1。酶活定義：一個(gè)乙醇脫氫酶酶活相當(dāng)于25℃、1 min氧化NAD+生成1 μmol NADH所需的酶量。

表1 乙醇脫氫酶酶活測(cè)定體系Table 1 Alcohol dehydrogenase enzyme activity assay system

采用考馬斯亮藍(lán)法[6]測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，根據(jù)以下公式[15]計(jì)算酶比活力：

式中，E340：340 nm 處每分鐘吸光值的增大值；Ew：100 μL 酶液中酶的質(zhì)量 （mg）；6.2：NADH 在 340 nm 下的毫摩爾吸光系數(shù)（mmol-1·cm-1）；3.6：試液的總體積（mL）。

1.2.5 乙醇脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)研究對(duì)重組酶的Km、最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、溫度穩(wěn)定性[16]（溫度范圍30～50℃）、pH穩(wěn)定性（廣泛緩沖液pH范圍3.0～11.0）、乙醇耐受性（0、500、1 000、1 500 mmol/L）進(jìn)行研究，并計(jì)算相對(duì)酶活。

乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)是將200 μL酶液分別與100 μL不同濃度的乙醇混合，使混合液中的乙醇終濃度分別為 0、500、1 000、1 500 mmol/L， 將混合液置于37℃水浴一定時(shí)間后取100 μL混合液測(cè)定剩余酶活。酶活測(cè)定時(shí)，加入反應(yīng)體系中的乙醇濃度分別做相應(yīng)調(diào)整，以確保參與反應(yīng)的乙醇濃度一致且為100 mmol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將 δδ-ADH的編碼基因 ADH7與 pMD19T-simple載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，選擇陽性克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。得到一條1 100 bp大小的目的條帶，與預(yù)期大小一致，測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 pMD19T-ADH7雙酶切電泳圖Fig.1Plasmid pMD19T-ADH7 digested by double enzymes

將重組質(zhì)粒pMD19T-ADH7轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），涂布菌液于含有100 μg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。由圖2可知，轉(zhuǎn)化子克隆出1 100 bp大小的條帶，說明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。

圖2 工程菌菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR product of engineering bacteria colony

2.2 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

陽性菌（pET-32a（+）-ADH7）于 37 ℃經(jīng) IPTG（終濃度1 mmol/L）誘導(dǎo)6 h，對(duì)發(fā)酵液上清液、全細(xì)胞、細(xì)胞破碎上清液及包涵體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，見圖3。 結(jié)果顯示，與對(duì)照菌株（pET-32a（+））相比，陽性菌在59 000附近出現(xiàn)一條新帶，且表達(dá)產(chǎn)物存在于陽性菌的包涵體中。經(jīng)分析可知，產(chǎn)物大小符合目的蛋白質(zhì)單亞基 （41 000）與融合標(biāo)簽（18 000）之和，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道相符，因此初步判定陽性菌的表達(dá)產(chǎn)物為目標(biāo)蛋白質(zhì)。

圖3 SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of δδ-ADH in different conditions

大腸桿菌可以在短時(shí)間里大量表達(dá)重組蛋白質(zhì)，但同時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成非活性的包涵體。包涵體形成與強(qiáng)的表達(dá)系統(tǒng)、高的誘導(dǎo)劑濃度以及相對(duì)較高的培養(yǎng)溫度有關(guān)[18]。為探索增加細(xì)胞中可溶性目的蛋白質(zhì)含量的誘導(dǎo)條件，將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)至OD600約為0.6后，對(duì)誘導(dǎo)劑濃度（IPTG 濃度分別為 0.05、0.1、0.5、1 mmol/L）、誘導(dǎo)溫度（誘導(dǎo)溫度分別為 15、20、25、30 ℃）及誘導(dǎo)時(shí)間（誘導(dǎo)時(shí)間分別為 2、4、6、8、10 h）進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示降低IPTG濃度、降低誘導(dǎo)溫度并不能增加細(xì)胞中可溶性目的蛋白質(zhì)的含量。綜合誘導(dǎo)劑成本及蛋白表達(dá)量，選擇的誘導(dǎo)條件是IPTG濃度為0.1 mmol/L、誘導(dǎo)溫度30℃、誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

2.3 重組δδ-ADH的純化

前期實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的方法[13-14]制備粗酶液，即先用含2 mol/L尿素的包涵體洗滌液清洗雜蛋白質(zhì)，再用含8 mol/L尿素的緩沖液溶解包涵體，然而溶解液經(jīng)稀釋復(fù)性后得到的粗酶液無活性。由于高濃度的變性劑會(huì)嚴(yán)重破壞重組蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生不可逆變性從而導(dǎo)致包涵體無法復(fù)性[19]，因此改用低濃度的尿素溶解包涵體，得到了有活性的包涵體溶解液。

用1 mol/L的尿素溶解包涵體，將該包涵體溶解液于8 000 r/min離心15 min，收集上清液得到有活性的粗酶液，酶比活力為0.202 U/mg。這說明包涵體中本身存在著近似天然的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，它以介于變性和復(fù)性狀態(tài)之間的中間體形式存在[20]，而用低濃度尿素在溶解蛋白質(zhì)聚集體的同時(shí)使蛋白質(zhì)天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)得以保留，從而使粗酶液表現(xiàn)出了酶活性。粗酶液經(jīng)鎳柱親和層析純化，上樣后開始收集流出液得到兩個(gè)峰，見圖4，穿透峰（第4～14管）和洗脫峰（第21～24管）。分別收集兩個(gè)峰的流出液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，見圖5。結(jié)果顯示洗脫峰中含有目標(biāo)蛋白質(zhì)。

圖4 HisTrapTMexcel色譜柱色譜圖譜Fig.4 Profiles of HisTrapTMexcel chromatography of proteins extracted from recombinant strain

圖5 乙醇脫氫酶δδ-ADH純化后的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE of δδ-ADH after purification

2.4 乙醇脫氫酶活性檢測(cè)及酶學(xué)性質(zhì)

對(duì)δδ-ADH的活性進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，純化后酶活為2.085 U/mg。利用不同濃度的乙醇（1、3、5、7、9、10 mmol/L）為底物，采用雙倒數(shù)作圖法（圖6）所得方程為y＝0.003 16＋0.089 84x（r=0.997 0），求得 δδ-ADH 的米氏常數(shù)Km為 28.43 mmol/L，Vmax為 316.46 μmol/（L·min）。

圖6 米氏常數(shù)的雙倒數(shù)作圖法Fig.6 Lineweaver-Burk plot for Km

溫度對(duì)δδ-ADH活性的影響見圖7。在25～40℃范圍內(nèi)，δδ-ADH的活性隨著溫度的升高而增高，在40℃時(shí)活性達(dá)到最大，超過40℃酶活不斷下降。

圖7 乙醇脫氫酶δδ-ADH最適溫度范圍Fig.7 Optimal temperature of δδ-ADH

pH對(duì)δδ-ADH酶活力的影響見圖8。在pH 3～5范圍內(nèi)，酶活僅為最高活性的10%左右，之后隨著pH的升高，酶活也不斷上升，pH 9.0時(shí)酶活達(dá)到最大值，當(dāng)pH>9.0時(shí)酶活不斷下降。Alberto Moreno[11]從人胃粘膜中分離到的δδ-ADH最適pH為9.9，隨著pH的不斷降低酶活不斷下降，與本研究結(jié)果相近。

取相同體積的酶液（pH 9.0）在 30、40、50 ℃溫浴，并分別于 15、30、60、90 min 時(shí)取樣并檢測(cè)酶活，以未溫浴的酶活為100%作圖。如圖9所示，δδ-ADH的酶活變化趨勢(shì)基本一致，在溫浴15～30 min時(shí)，酶活下降較快；在50℃溫浴60 min后，相對(duì)酶活約為47%，在40℃溫浴60 min相對(duì)酶活為55%。

圖8 乙醇脫氫酶δδ-ADH最適pH范圍Fig.8 Optimal pH of δδ-ADH

圖9 乙醇脫氫酶δδ-ADH溫度穩(wěn)定性Fig.9 Effect of temperature on the stability of δδ-ADH

正常情況下，人體胃液的pH值范圍是1.0～4.0，飲水或進(jìn)食后可上升到3.0～5.0[21]。δδ-ADH對(duì)胃生理環(huán)境，尤其是對(duì)酸性環(huán)境的耐受性將影響其活性的發(fā)揮[2]。如圖10所示，將δδ-ADH在不同pH（pH 3～11）的廣泛緩沖液中于25℃保溫30 min，在pH 6.0～11.0范圍內(nèi)酶活較穩(wěn)定；pH 10.0時(shí)酶活力最高；pH 5.0條件下，相對(duì)酶活為60%；在pH 4.0以下，檢測(cè)不到酶活。

取相同體積的酶液在0、500、10 00、1 500 mmol/L乙醇中37℃溫浴，于10、20、30 min時(shí)取樣檢測(cè)酶活。如圖11所示，在0 mmol/L乙醇中37℃溫浴30 min的δδ-ADH的相對(duì)酶活為65.6%。在500 mmol/L乙醇中溫浴10 min后，δδ-ADH的相對(duì)酶活下降至95%左右，溫浴30 min后相對(duì)酶活為51.1%。在1 000、1 500 mmol/L乙醇中溫浴10 min后，δδ-ADH酶活下降至60%左右，隨著溫浴時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活下降速率減慢，溫浴30 min后相對(duì)酶活分別為45.4%和44.4%，說明δδ-ADH可在高濃度乙醇中保持一定活力。

圖10 乙醇脫氫酶δδ-ADH pH穩(wěn)定性Fig.10 Effect of pH on the stability of δδ-ADH

圖11 乙醇脫氫酶δδ-ADH的乙醇耐受性Fig.11 Effect of alcohol on the stability of δδ-ADH

3 結(jié) 語

作者通過構(gòu)建pET-32a（+）-ADH7表達(dá)載體，將人胃來源的乙醇脫氫酶δδ-ADH在E.coliBL21（DE3）中進(jìn)行外源表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，目的產(chǎn)物以包涵體形式存在，且其大小符合目的蛋白質(zhì)單亞基（41 000）與融合標(biāo)簽（18 000）之和，即59 000。

包涵體用1 mol/L的尿素作初步的溶解處理，將此包涵體溶解液離心取上清液，得到有活性的δδ-ADH粗酶液，酶比活力為0.202 U/mg。粗酶液進(jìn)一步經(jīng)鎳柱親和層析純化，純化后酶的比活力為2.085 U/mg。在制備有活性的粗酶液的過程中，在用含低濃度尿素的緩沖液溶解包涵體前省略了傳統(tǒng)方法中洗滌包涵體的步驟，因此粗酶液中含有較多雜蛋白質(zhì)，由于尿素濃度較低，溶解液中目的蛋白質(zhì)并不占主體地位。通過對(duì)工程菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)及優(yōu)化包涵體溶解條件等途徑以提高酶的得率，將是本研究繼續(xù)努力的方向。

對(duì)δδ-ADH的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該酶的Km為 28.43 mmol/L，Vmax為 316.46 μmol/（L·min），最適溫度為40℃，最適 pH為 9.0，在 30～50℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定，溫浴60 min后相對(duì)酶活在47%以上；在pH 5.0～10.0較穩(wěn)定，溫育30 min后相對(duì)酶活在60%以上。此外，該酶能耐受一定濃度的乙醇，在500～1 500 mmol/L乙醇中保持30 min，相對(duì)酶活在45%以上。

然而，δδ-ADH在酸性環(huán)境下活性不高且穩(wěn)定性差，其原因可能是δδ-ADH存在于胃粘膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[1，5]，正常的胃粘膜具有胃屏障功能，其中的一個(gè)重要作用是防止胃腔里的鹽酸從胃腔回滲到胃粘膜細(xì)胞里[22]，從而使δδ-ADH避免了直接暴露在酸性環(huán)境下。鑒于δδ-ADH的這一缺點(diǎn)，今后將通過酶的固定化、化學(xué)修飾或分子生物學(xué)等手段提高該酶在酸性條件下的穩(wěn)定性，以擴(kuò)大該酶的應(yīng)用范圍。