劉玲 曾玉坤 丁紅珂 姚翠澤 余麗華 劉暢 張彥

廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心（廣州 511400）

耳聾位居我國(guó)各類殘障之首，據(jù)全國(guó)第二次殘疾人抽樣調(diào)查主要數(shù)據(jù)顯示我國(guó)聽力殘疾者高達(dá)2780萬，新生兒耳聾發(fā)生率為1‰-3‰，嚴(yán)重影響出生人口素質(zhì)和國(guó)民健康[1]。統(tǒng)計(jì)表明60%的耳聾患者為遺傳變異所致。遺傳性耳聾根據(jù)表型分類為綜合征型耳聾（約30%）和非綜合征型耳聾（約70%）。在非綜合征型耳聾中，最常見遺傳方式為常染色體隱性遺傳[2]。因此，在正常聽力人群中存在較多耳聾致病基因突變攜帶者，發(fā)現(xiàn)攜帶者并進(jìn)行配偶相關(guān)檢測(cè)可以有效防治遺傳性耳聾患兒的發(fā)生。

GJB2、SLC26A4、線粒體MT-RNR1基因是中國(guó)遺傳性耳聾三個(gè)最常見的致病基因[2]。本研究對(duì)廣東地區(qū)46587名正常聽力育齡女性進(jìn)行耳聾基因熱點(diǎn)突變檢測(cè)，對(duì)于攜帶者進(jìn)行配偶相關(guān)基因的編碼區(qū)檢測(cè)，對(duì)于有家族史及產(chǎn)前診斷要求的進(jìn)行規(guī)范化檢測(cè)；同時(shí)對(duì)694名非綜合征型耳聾患者進(jìn)行GJB2、SLC26A4基因編碼區(qū)所在外顯子及側(cè)翼區(qū)序列檢測(cè)。初步得到了廣東地區(qū)遺傳性耳聾基因熱點(diǎn)突變攜帶率及非綜合征型耳聾患者中常見耳聾基因突變數(shù)據(jù)；初步完成了廣東人群遺傳性耳聾出生缺陷防控臨床基因檢測(cè)方案的效果評(píng)估。

1 對(duì)象與方法

本研究所有對(duì)象均為2011年1月至2019年5月期間在廣東省婦幼保健院就診或咨詢?nèi)藛T，所有檢測(cè)方案均經(jīng)過詳細(xì)的知情同意告知。

1.1 熱點(diǎn)篩查

46587 例正常聽力孕前∕產(chǎn)前且無耳聾家族史女性，年齡15～53歲,經(jīng)受檢者知情同意后采集外周血2mL（EDTA抗凝），取300μl全血采用磁珠法提取基因組DNA（廈門至善生物科技有限公司），Nanodrop2000（Thermo，美國(guó)）定量后按照說明書用晶芯TM9項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒（北京博奧生物有限公司）進(jìn)行致聾基因熱點(diǎn)突變篩查。

1.2 攜帶者配偶相應(yīng)基因檢測(cè)

采集外周血2mL（EDTA抗凝），取300ul全血采用磁珠法提取基因組DNA（廈門至善生物科技有限公司），Nanodrop2000（Thermo，美國(guó)）定量后采用PCR-Sanger技術(shù)對(duì)受試者采用芯片結(jié)合GJB2或SLC26A4基因編碼區(qū)所在外顯子及側(cè)翼區(qū)序列測(cè)定與分析，其中GJB2基因由于序列短，所有受試者均進(jìn)行GJB2基因檢測(cè)。

1.3 耳聾患者檢測(cè)

經(jīng)過臨床醫(yī)師評(píng)估除了聽力障礙外沒有其他臨床特征的694例非綜合征型耳聾患者，年齡2個(gè)月～53歲，其中男性和女性分別為378例、316例，除2例患者來自同一家系，其余患者均來自不同家系。所有患者經(jīng)知情同意后采集外周血2mL（EDTA抗凝），磁珠法提取基因組DNA（廈門至善生物科技有限公司），Nanodrop2000（Thermo，美國(guó)）定量后進(jìn)行芯片結(jié)合GJB2和SLC26A4基因編碼區(qū)所在外顯子及側(cè)翼區(qū)序列測(cè)定及分析。變異生物信息學(xué)分析主要采用dbSNP、Clinvar、HGMD、遺傳性 耳 聾 網(wǎng) 站（https:∕hereditaryhearingloss.org）和SIFT、PolyPhen、MutationTaster等數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件進(jìn)行分析。

1.4 產(chǎn)前診斷

80個(gè)正常聽力孕前∕產(chǎn)前且無耳聾家族史攜帶者及其配偶為同基因攜帶者家系和90個(gè)有家族史的同基因致病突變攜帶者夫婦或夫婦雙方耳聾且為同基因致病突變攜帶家系，在進(jìn)一步知情同意下選擇產(chǎn)前診斷。共計(jì)170例孕婦經(jīng)超聲介導(dǎo)行絨毛、羊膜腔、臍血穿刺術(shù)取得胎兒樣本。產(chǎn)前標(biāo)本DNA提取采用德國(guó)Qigen公司生產(chǎn)的QiampDNA Blood MiniKit提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。產(chǎn)前標(biāo)本采用熒光多重PCR毛細(xì)管電泳法同時(shí)檢測(cè)母親及胎兒13、18、21號(hào)染色體上的13個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記以鑒別母血污染后利用PCR-Sanger技術(shù)進(jìn)行特定基因位點(diǎn)的產(chǎn)前基因檢測(cè)。

表1 13452例育齡女性耳聾篩查情況表Table 1 The prenatal screening of deafness-related genes in 13452 normal hearing women of childbearing age

2 結(jié)果

2.1 正常聽力育齡女性耳聾熱點(diǎn)基因突變篩查

在46587例正常聽力育齡女性，共檢出攜帶者1583例，總體攜帶率為3.40%，其中GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體MT-RNR1基因的攜帶率分別為1.88%、1.17%、0.14%、0.19%。在攜帶者中，GJB2基因的235delC和SLC26A4基因IVS7-2A＞G兩個(gè)位點(diǎn)合計(jì)占比達(dá)75.8%（表1）。另14例女性篩查提示為雙重雜合突變，其中GJB2基因c.235delc雙重雜合SLC26A4基因IVS7-2A＞G的基因篩查芯片結(jié)果如圖1所示。

圖1 GJB2基因c.235delC雙重雜合SLC26A4基因IVS7-2A＞G的芯片結(jié)果Fig.1 The chip result of GJB2 gene c.235delC double heterozygote SLC26A4 gene IVS7-2A＞G

2.2 攜帶者配偶相應(yīng)基因檢測(cè)

1583例攜帶者中，GJB2、SLC26A4基因致病突變攜帶者為1431，其中847例GJB2、SLC26A4基因致病突變攜帶者配偶選擇進(jìn)一步基因檢測(cè)。共檢測(cè)到27種變異,其中以GJB2基因的c.109G＞A、c.235delC和SLC26A4基因IVS7-2A＞G突變?yōu)橹鳌Ｔ跀y帶者配偶中c.109變異的人群攜帶率高達(dá)15.58%，c.109 G＞A的等位基因頻率為8.03%（136∕1694）（表2）。

表2 847例攜帶者配偶相應(yīng)基因序列分析結(jié)果Table 2 Related gene sequencing results of spouses of carriers

在該部分人群中，2例自訴表現(xiàn)為弱聽（基因型分別為GJB2基因c.109G＞A純合、GJB2基因c.235delC復(fù)合c.109G＞A），其余均自訴聽力正常。

2.3 694例非綜合征型耳聾患者基因檢測(cè)

2.3.1 694例非綜合征型耳聾患者基因檢測(cè)變異情況

在694例非綜合征型耳聾患者中，共檢測(cè)到78種變異（表3）。

表3 694例非綜合征性耳聾患者變異情況表Table 3 Variants in 694 nonsyndromic hearing loss(NSHL)subjects

GJB2基因序列分析發(fā)現(xiàn)21種變異，其中14種為已經(jīng)報(bào)道致病突變，另有7種變異與疾病的關(guān)系尚未明確。在這個(gè)7個(gè)意義不明變異中，其中4個(gè)變異在dbSNP、Clinvar、HGMD、遺傳性耳聾網(wǎng)站（https:∕hereditaryhearingloss.org）等數(shù)據(jù)庫(kù)未見報(bào)道。

SLC26A4基因序列分析發(fā)現(xiàn)54種變異，其中32種為已經(jīng)報(bào)道致病變異，另22種變異與疾病的關(guān)系尚未明確。在這22個(gè)意義不明變異中，其中16個(gè)變異在dbSNP、Clinvar、HGMD、遺傳性耳聾網(wǎng)站（https:∕hereditaryhearingloss.org）等數(shù)據(jù)庫(kù)未見報(bào)道。

另在耳聾患者中，發(fā)現(xiàn)20例患者為線粒體MT-RNR1基因致聾突變，在1例患者中發(fā)現(xiàn)GJB3基因c.538C＞T雜合變異。

2.3.2 意義不明變異分析

本研究中共發(fā)現(xiàn)29種GJB2/SLC26A4變異與疾病的關(guān)系尚未明確，其中22種變異在耳聾患者同一基因僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)變異位點(diǎn)或2個(gè)同基因變異位點(diǎn)均為未明確致病變異或已發(fā)現(xiàn)2個(gè)明確致病位點(diǎn)，根據(jù)ACMG分類指南其致病性尚不明確。另7種變異數(shù)據(jù)庫(kù)未見報(bào)道且在耳聾患者中僅復(fù)合雜合1個(gè)已知致病突變，其中GJB2基因c.191G＞C和SLC26A4基因c.419C＞T根據(jù)ACMG分類指南可分類為可能致病變異，具體臨床資料和致病性分析如下：

患者1臨床表現(xiàn)為先天性極重度雙側(cè)感音神經(jīng)性耳聾，無耳聾家族史，基因型為GJB2基因c.235delC復(fù)合雜合c.191G＞C（未行雙親驗(yàn)證）。SIFT、PolyPhen、MutationTaster等預(yù)測(cè)軟件提示為c.191G＞C(p.C64S)致病突變，文獻(xiàn)報(bào)道[3]同一位點(diǎn)c.191 G＞A(p.C64Y)與感音神經(jīng)性耳聾相關(guān)，據(jù)此按照ACMG分類指南可將c.191 G＞C分類為可能致病變異。

患者2-7臨床均表現(xiàn)為先天性雙側(cè)耳聾、耳部CT提示雙前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大等，均無耳聾家族史，序列分析提示除1個(gè)SLC26A4基因致病突變外，均復(fù)合雜合1或2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)未見報(bào)道變異，分別為c.304+3delA、c.380A＞G、c.419C＞T、c.956T＞G∕c.958G＞A、c.1352C＞A，SIFT、PolyPhen、MutationTaster等預(yù)測(cè)軟件提示上述位點(diǎn)為致病突變。c.419 C＞T（p.P140L）經(jīng)后代驗(yàn)證該變異與另1致病突變以反式方式排列，且同一位點(diǎn)c.419C＞A（p.P140H）有文獻(xiàn)報(bào)道[4]與Pendred綜合征相關(guān),根據(jù)ACMG分類指南可將其分類為可能致病。其余4例患者均因未進(jìn)行雙親或后代驗(yàn)證，根據(jù)ACMG分類指南將其分類為意義不明變異。

2.3.3 同一個(gè)基因多位點(diǎn)變異位于同一條染色體的患者情況

8例患者經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)同一基因存在3個(gè)位點(diǎn)變異或者1個(gè)位點(diǎn)純合變異復(fù)合另1位點(diǎn)雜合，基因型分別為：GJB2基因c.235delC純合+c.299delAT雜合、GJB2基因c.235delC純合+c.282C＞T雜合、SLC26A4基因c.1229C＞T雜合+c.956T＞G 雜 合 +c.958G＞A 雜 合 、SLC26A4基 因c.1975G＞C雜合+c.1229C＞T雜合+c.1548_1549ins C雜合、SLC26A4基因IVS 7-2A＞G雜合+c.1229C＞T雜合+c.1975G＞C雜合、SLC26A4基因IVS 7-2A＞G雜合+c.1588T＞C雜合+c.1578C＞A雜合、SLC26A4基 因 IVS7-2A＞G 雜 合 +IVS13+5G＞A 雜 合 +c.1300G＞A雜合、SLC26A4基因IVS7-2A＞G雜合+c.1174A＞T雜合+c.463A＞G雜合。

基因型為SLC26A4基因c.1975G＞C雜合+c.1229C＞T雜合+c.1548_1549insC雜合的患者經(jīng)過家系分析提示c.1975G＞C、c.1229C＞T位于同一條染色體，遺傳自父親。其余7例患者均未選擇進(jìn)一步雙親驗(yàn)證，通過基因型分析2例基因型分別為GJB2基因c.235delC純合+c.299delAT雜合,GJB2基因c.235delC純合+c.282C＞T雜合的患者中c.235delC、c.299delAT和c.235delC、c.282C＞T也位于同一條染色體。

2.4 產(chǎn)前診斷檢測(cè)結(jié)果

共計(jì)170對(duì)同基因致病突變攜帶者夫婦通過知情選擇產(chǎn)前診斷，其中39例胎兒遺傳了來自父母雙方的基因突變、45例胎兒未遺傳來自父母雙方的基因突變，86例為攜帶者（表4）。

術(shù)后隨訪，24例孕婦因胎兒遺傳來自父母雙方基因突變選擇終止妊娠，另有1例因合并其他超聲畸形選擇終止妊娠。25例終止妊娠胎兒中，8例產(chǎn)前診斷基因型為c.109G＞A純合或復(fù)合其他已知致病突變（5例有耳聾家族史）。產(chǎn)后電話隨訪進(jìn)行產(chǎn)前診斷孕婦的新生兒聽力情況，所有成功隨訪家庭均自訴新生兒聽力篩查均為正常，其中包含8例產(chǎn)前診斷基因型為GJB2基因c.109G＞A純合或復(fù)合其他已知致病突變新生兒。

表4 170例胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果Table 4 Prenatal diagnosis results of 170 fetuses

3 討論

截止到目前，已經(jīng)鑒定出119個(gè)基因與非綜合征型耳聾相關(guān)，其中76個(gè)基因與常染色體隱性非綜合征性耳聾基因相關(guān)[6]。在我國(guó)常見的非綜合征型耳聾致病基因?yàn)镚JB2、SLC26A4、線粒體MT-RNR1。

在本研究中，46587例正常聽力育齡女性耳聾基因熱點(diǎn)突變檢測(cè)結(jié)果提示人群耳聾基因突變攜帶率為3.40%，其中GJB2、SLC26A4、GJB3、MT-RNR1基因的熱點(diǎn)突變陽性率分別為1.88%、1.17%、0.14%、0.19%。攜帶者中以GJB2基因的c.235delC和SLC26A4基因IVS7-2A＞G居多，兩個(gè)位點(diǎn)合計(jì)占比高達(dá)75.8%。這與我們?cè)缙趫?bào)道數(shù)據(jù)一致[7，8]。人群攜帶率略低于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)相關(guān)報(bào)道[9，10]。

此外，本研究在46587例正常聽力且無耳聾家族史的育齡女性中分別檢測(cè)到線粒體MT-RNR1、GJB3基因突變攜帶者89例、63例。線粒體MT-RNR1基因突變是氨基糖苷類藥物致聾的重要機(jī)制，絕大部分為母系遺傳。對(duì)于篩查提示為線粒體MT-RNR1基因突變的攜帶者，均建議本人、子女及其母系親屬禁止使用氨基糖苷類藥物并提供用藥指南。GJB3基因?yàn)槲覈?guó)克隆的第一個(gè)基因，早期研究認(rèn)為其與常染色顯性遺傳的高頻聽力受損相關(guān)[11]，但近年來該對(duì)該變異的致病性存在爭(zhēng)議[12]。本研究隨訪63例GJB3基因c.538C＞T攜帶者，針對(duì)聽力情況特別是高頻區(qū)域是否受損進(jìn)行問詢，所有受檢者均自訴聽力正常但未進(jìn)行耳鼻喉科專業(yè)檢查，其中包含1例c.538C＞T純合受檢者。對(duì)此，臨床上GJB3基因c.538C＞T攜帶者的遺傳咨詢建議需要謹(jǐn)慎。

遺傳性耳聾有明顯的地區(qū)及種族差異，不同地區(qū)及種族在基因突變譜及突變頻率存在差異性。例如在東亞人群中GJB2基因以c.235delC為主，而在猶太人群種以c.167delT為主，而c.35delG突變?cè)跉W洲和美國(guó)更為普遍[13]。在本研究中，c.35delG在正常聽力育齡女性中僅檢測(cè)到3例，在耳聾患者中未發(fā)現(xiàn)。在東亞地區(qū)，GJB2基因和SLC26A4基因的突變譜大部分一致，但是各突變位點(diǎn)在不同人群中的頻率卻存在差異。本研究數(shù)據(jù)及其他國(guó)內(nèi)研究[14]顯示，IVS7-2A＞G是中國(guó)人SLC26A4基因最常見的致病突變，但是在日本[15]和韓國(guó)[16]SLC26A4基因最常見的致病突變?yōu)閏.2168A＞G。本研究收集我院近8年四萬多例數(shù)據(jù)，能較好地反映廣東地區(qū)正常聽力育齡女性耳聾基因攜帶情況。

在847例攜帶者配偶相應(yīng)基因檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)15.58%的受檢者帶有c.109變異，其中6例基因型為c.109G＞A純合或復(fù)合雜合c.235delC，除2例自訴為弱聽外其他均無耳聾臨床表現(xiàn)。在694例耳聾患者中c.109G＞A的陽性率高達(dá)25.22%，其中c.109G＞A純合或復(fù)合GJB2基因其他已知致病突變位點(diǎn)的耳聾患者為56例。56例患者臨床表現(xiàn)差異巨大，從單側(cè)到雙側(cè)、先天到后天漸進(jìn)、輕度到極重度耳聾患者均有出現(xiàn)。隨訪成功的7例產(chǎn)前診斷基因型為c.109G＞A純合或復(fù)合雜合GJB2基因其他已知致病突變的新生兒，家屬均訴通過,但是后期的臨床表型仍需進(jìn)一步隨訪。c.109G＞A的臨床致病性仍存在爭(zhēng)議，目前研究認(rèn)為其致病可能性較大[17，18]，但臨床表型異質(zhì)性大，多表現(xiàn)為輕度或中度耳聾，且發(fā)病年齡不一。本研究中，c.109G＞A在患者中的等位基因頻率為15.56%，明顯高于正常聽力的攜帶者配偶人群中的等位基因頻率（8.03%），這一結(jié)果也為GJB2基因c.109G＞A為致病性突變提供了證據(jù)。臨床對(duì)于c.109G＞A的遺傳咨詢建議，需要充分告知其臨床表型的異質(zhì)性，以及定期監(jiān)測(cè)聽力情況的必要性。

在694例非綜合征型耳聾患者中，共檢測(cè)到78種變異，其中GJB2、SLC26A4基因共檢測(cè)到75種變異。在75種GJB2、SLC26A4基因變異中，除已報(bào)道46個(gè)GJB2、SLC26A4基因的致病突變，還發(fā)現(xiàn)29個(gè)意義不明變異，其中20個(gè)變異在dbSNP、Clinvar、HGMD、遺傳性耳聾網(wǎng)站（https:∕hereditaryhearingloss.org）等數(shù)據(jù)庫(kù)未見報(bào)道，進(jìn)一步豐富了遺傳性耳聾的基因突變譜。臨床遺傳咨詢中，對(duì)于攜帶意義不明變異耳聾患者，需從臨床表型、遺傳方式、生物信息學(xué)分析、家系分析、功能分析等多方位綜合告知其致病性分析推測(cè)結(jié)果。本研究中，c.304+3delA、c.380A＞G、c.956T＞G∕c.958G＞A、c.1352C＞A根據(jù)ACMG分類指南與疾病的關(guān)系尚未明確，除了功能學(xué)分析需要進(jìn)一步研究外，家系分析對(duì)于變異致病性分類推測(cè)是較為容易實(shí)現(xiàn)的環(huán)節(jié)，但是部分臨床醫(yī)生和患者對(duì)家系分析的重視度不夠，以至于對(duì)于該類變異的分類尚不能明確。對(duì)于分析推測(cè)為可能致病的變異，如本研究中的GJB2基因c.191G＞C和SLC26A4基因c.419C＞T，尚需更多患者和功能研究驗(yàn)證其致病性，對(duì)于攜帶該類變異患者需要知情告知其風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于其他意義不明變異，其不排除檢測(cè)范圍外的其他致病突變或其他致病基因致病可能性，遺傳咨詢建議患者親屬知情選擇相應(yīng)基因檢測(cè)或者患者進(jìn)一步檢測(cè)。近年來，隨著技術(shù)的不斷更新和測(cè)序技術(shù)成本的降低，高通量測(cè)序在臨床應(yīng)用越來越廣泛的應(yīng)用，雖然目前高通量測(cè)序在臨床的大規(guī)模使用尚存在一系列問題，但相信隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，更多未明確診斷的患者能夠得到診斷。

另在遺傳咨詢中，需要注意對(duì)于同一基因多位點(diǎn)突變的患者進(jìn)行雙親或者后代驗(yàn)證。在本研究中有8例患者經(jīng)過序列分析存在同一個(gè)基因多位點(diǎn)變異位于同一條染色體的情況，其中5個(gè)家系未排除致病突變?yōu)榉词脚帕械那闆r，不排除同一基因多位點(diǎn)突變位于同一染色體，不排除其為SLC26A4基因致病突變攜帶者的情況。

此外，在非綜合征型耳聾患者中，GJB2基因c.109、c.235delC、c.299_300delAT及SLC26A4基因IVS7-2A＞G、c.754T＞C、c.1229C＞T、c.2086C＞T、c.1548insC、c.2168A＞G 和線粒體MT-RNR1基因m.1555A＞G為最常見的熱點(diǎn)突變，與目前國(guó)內(nèi)其他地區(qū)已報(bào)道文獻(xiàn)部分等位基因頻率存在差異[19，20]，與這為中國(guó)人群遺傳性耳聾基因突變熱點(diǎn)篩查工作提供了廣東地區(qū)重要的參考信息，但對(duì)于耳聾篩查熱點(diǎn)突變的篩選尚需國(guó)內(nèi)多地區(qū)、大樣本進(jìn)一步研究。

本研究通過分析廣東地區(qū)46587例正常聽力育齡女性的耳聾基因篩查情況及694例非綜合征型耳聾患者的遺傳性耳聾基因突變譜，對(duì)廣東人群遺傳性耳聾出生缺陷臨床防控模式進(jìn)行大樣本的探索，為耳聾基因篩查方案、耳聾診斷策略及遺傳咨詢補(bǔ)充了重要數(shù)據(jù)依據(jù)。