郝亞琳，金曉杰，趙輝，何平，張佳鳳，董瓊娜，施薇薇，趙苗苗

（上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院南院 耳鼻咽喉頭頸外科，上海 201112）

鼻咽癌起源于鼻咽部黏膜上皮，是頭頸部腫瘤中最常見的類型之一[1]，在我國南方和一些東南亞國家很常見，發(fā)病率為20～30/10萬[2]。目前，在疾病發(fā)現(xiàn)早期，放射治療已被證明是最有效的治療方法[3]。然而，75%～90%鼻咽癌的診斷處于晚期[4]，腫瘤細胞已發(fā)生局部或區(qū)域擴散[5]，影響鼻咽癌的有效治療，并存在復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移的高風險[6]，降低完全根治腫瘤的概率。因此篩選更為敏感和特異性的生物標志物對鼻咽癌的治療至關(guān)重要。

人類基因組工程的結(jié)果表明，僅有不到3%的人類基因組序列編碼蛋白質(zhì)，超過75%基因組序列轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，包括微小RNA（microRNA，miRNA）[7]和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[8-9]。lncRNA作為一種潛在的生物學活性調(diào)節(jié)因子，廣泛參與細胞活動，如細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲。lncRNA幾乎可以調(diào)控腫瘤細胞的各個方面，包括細胞生長、細胞周期、細胞凋亡、細胞衰老、細胞遷移和侵襲、耐藥性等[9]。因此，lncRNA成為抑制腫瘤及其致癌基因的調(diào)控靶點[10-12]。

在鼻咽癌中，lncRNA的表達和作用尚不清楚。KONG等[13]報道，鼻咽癌中l(wèi)ncRNA LINC00460水平增加，促進腫瘤發(fā)生。GUO等[14]報道lncRNA LINC0086在鼻咽癌中表達降低，發(fā)揮抑癌作用。SONG等[10]報道lncRNA EWSAT1在鼻咽癌中高表達，促進鼻咽癌細胞生長。MIAT也被稱為Gomafu或Rncr2，位于22q12.1，長度為30 051 bp，在肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、慢性淋巴細胞性白血病、膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達異常[15-18]。研究表明，lncRNA MIAT通過競爭內(nèi)源性RNA機制調(diào)控miRNA的表達水平，從而抑制癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[18-20]。然而，MIAT在鼻咽癌調(diào)控中的作用仍未明確。本研究對鼻咽癌細胞中MIAT表達水平進行分析，并分析其對miR-124水平的影響，進一步探討其對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲方面的影響，為識別新的鼻咽癌診斷策略與治療靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；BCA法蛋白濃度檢測試劑盒和MTT試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；抗β-catenin抗體、抗cyclin D1抗體、抗c-Myc抗體、抗β-actin抗體和辣根過氧化物標記的二抗購自英國Abcam公司；Lipo-fectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；mimic NC、miR-124 mimic、in-hibitor NC及miR-124 inhibitor購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染:鼻咽癌細胞系（HONE-1，SUNE-1，C666-1）和鼻咽上皮細胞系NP-69取自中山大學。無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)NP-69 細胞；添加有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HONE-1、SUNE-1、C666-1細胞，均培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。以cDNA為模板，采用Pfu DNA聚合酶擴增MIAT序列并連接到pcDNA3.1載體的Hind III和EcoR I位點之間，構(gòu)建MIAT過表達載體pcDNA-MIAT。pcDNA-MIAT或其對照pcDNA、si-MIAT或其對照si-NC、miR-124 inhibitor或其對照inhibitor NC通過Lipofectamine 2 000試劑盒轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細胞。

1.2.2 RT-qPCR:培養(yǎng)鼻咽癌細胞至對數(shù)期，采用TRIzol法提取總RNA，檢測RNA的純度及濃度。以總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴增得到cDNA。采用SYBR Green PCR試劑盒，分別以GAPDH與U6 snRNA分子為內(nèi)參進行RT-qPCR檢測MIAT與miR-124表達水平。引物序列:MIAT F:5’-CAAAGAGCCCTCTGCACT A-3’，R:5’-ACCTTGGTTACCCCTGTGATG-3’；miR-124 F:5’-CGCGCGCGUAAGGCACGCGGUGAA-3’:R:5’-ATCCAGTGC AGGGTCCGAGG-3’；GAPDH F:5’-CAGCCTCAAGATCATCAG CA-3’；R:5’-ATGATGTTCTGGAGAGCCCC-3’；U6 F:5’-CT CGCTTCGGCAGCACA-3’，R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3’。根據(jù)2-ΔΔCt方法計算MIAT與miR-124的相對表達水平，每組設(shè)置3個平行。RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與定量PCR條件與反應(yīng)體系均按照對應(yīng)說明書進行操作。

1.2.3 雙熒光素酶系統(tǒng)檢測:在線軟件預(yù)測MIAT與miR-124的結(jié)合位點。將含此片段的MIAT序列連接至雙熒光素酶載體pGL3，得到pGL3-MIAT-wt載體。同時，通過定點突變將結(jié)合位點突變（Mut，GCACTTT→CGTGAAA）構(gòu)建突變質(zhì)粒pGL3-MIAT-mut。為研究MIAT與miR-124的相互作用，將鼻咽癌細胞HONE-1接種于96孔板中24 h，當細胞達到50%～70%匯合時，分別將MIAT-wt或MIAT-mut質(zhì)粒與mimic NC、miR-124 mimic、inhibitor NC及miR-124 inhibitor同時轉(zhuǎn)染HONE-1細胞。用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定48 h熒光素酶活性。

1.2.4 Western blot:收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞培養(yǎng)液，離心后加入蛋白裂解液反應(yīng)30 min，提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，采用SDSPAGE分離等量的蛋白質(zhì)，濕法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶/TBST封閉，一抗過夜孵育后，TBST清洗后加入二抗，室溫下孵育90 min。加入ECL顯色劑后置于凝膠成像儀檢測目標蛋白水平。

1.2.5 MTT法測定鼻咽癌細胞增殖:培養(yǎng)鼻咽癌細胞HONE-1至對數(shù)生長期并制成細胞懸液，以1×103個/孔接種至96孔板內(nèi)，重復(fù)5孔。待培養(yǎng)24 h后分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-MIAT、si-MIAT+inhibitor NC、si-MIAT+miR-124 inhibitor。繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h，離心棄去上清液，每孔加入0.1 mg的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL二甲基亞砜溶解，490 nm處檢測OD值，取平均值繪制細胞增殖曲線。

1.2.6 Transwell細胞遷移與侵襲試驗:將分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-MIAT、si-MIAT+inhibitor NC、si-MIAT+miR-124 inhibitor的鼻咽癌細胞HONE-1培養(yǎng)至對數(shù)生長期并制成細胞懸液，用無血清培養(yǎng)基漂洗3遍，細胞計數(shù)。侵襲試驗中，在Transwell小室上室加入200 μL稀釋的Matrigel膠，過夜干燥。分別在Transwell小室上室接種200 μL（1×105個/mL）細胞懸液，在小室的下室加入300 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS浸泡洗滌2次。95%乙醇浸泡固定Transwell上室穿膜細胞，PBS洗滌2次，以新鮮配制的結(jié)晶紫染液浸染3～5 min，然后用棉簽擦除上室中未通過濾膜的細胞，顯微鏡下觀察拍照、計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以±s 表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌細胞中MIAT表達上調(diào)鼻咽癌細胞中MIAT表達水平明顯高于NP-69細胞。其中HONE-1細胞中MIAT表達水平最高，是NP-69細胞的4.47倍（P＜0.05）。見圖1。這些結(jié)果表明MIAT水平可能與鼻咽癌發(fā)展相關(guān)。由于鼻咽癌細胞HONE-1中MIAT表達水平最高，因此，我們選擇HONE-1細胞進行進一步研究。

2.2 HONE-1細胞中MIAT調(diào)控miR-124水平越來越多的證據(jù)表明，lncRNA可能充當內(nèi)源競爭RNA與miRNA相互作用。因此，我們利用在線軟件DIANA檢索與MIAT具有互補堿基配對的miRNA。在與形成互補堿基配對的miRNA列表中，我們重點關(guān)注miR-124，其與鼻咽癌細胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。為探究MIAT與miR-124功能之間的相關(guān)性，本研究采用熒光素酶作為報告基因檢測MIAT是否是miR-124的功能靶點。結(jié)果顯示，miR-124 mimic可降低含有MIAT片段報告質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＜0.05），但對結(jié)合位點發(fā)生突變報告質(zhì)粒的熒光素酶活性沒有影響。隨后通過miR-124 inhibitor抑制miR-124的表達，結(jié)果顯示，抑制miR-124的表達，其熒光素酶活性顯著提升（P＞0.05），而突變體的熒光素酶活性沒有變化。見圖2A。這些結(jié)果表明miR-124可以在特定識別位點直接與MIAT結(jié)合。采用熒光定量PCR分析MIAT與miR-124表達水平之間的相關(guān)性。過表達MIAT時，miR-124表達水平明顯下降，而干擾MIAT的表達則升高（P＜0.05），這表明MIAT與miR-124之間可相互結(jié)合，見圖2B。綜上所示，鼻咽癌細胞中MIAT可抑制miR-124的表達。

圖1 熒光定量PCR檢測鼻咽癌細胞中MIAT表達水平

2.3 MIAT通過miR-124調(diào)節(jié)HONE-1細胞增殖與對照si-NC組OD值（0.467±0.025）相比，轉(zhuǎn)染si-MIAT 24 h后實驗組細胞的OD值（0.253±0.025）明顯降低（P ＜0.05）。為進一步研究抑制MIAT表達后miR-124對鼻咽癌細胞增殖的影響，采用miRNA抑制劑干擾miR-124 的表達。結(jié)果顯示，與對照組（si-MIAT+inhibitor NC）相比，轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor的鼻咽癌細胞增殖能力顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。以上結(jié)果表明，利用siRNA對鼻咽癌細胞的MIAT進行干擾后，MIAT通過下調(diào)miR-124的表達豐度促進鼻咽癌細胞增殖。

2.4 MIAT通過miR-124調(diào)節(jié)HONE-1細胞遷移和侵襲結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，si-MIAT組中穿過Transwell上室的細胞較對照組（si-NC）明顯減少（見圖4）。為進行定量分析，隨機統(tǒng)計5個視野中每個視野下的細胞數(shù)量。結(jié)果顯示實驗組（si-MIAT）每個視野的平均細胞數(shù)量明顯低于對照組（P＜0.05）。進一步分析miR-124 inhibitor對鼻咽癌細胞遷移與侵襲能力的影響顯示，與對照組（si-MIAT+inhibitor NC）相比，轉(zhuǎn)染組（si-MIAT+miR-124 inhibitor）細胞遷移與侵襲能力顯著提高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，MIAT通過干擾鼻咽癌細胞中miR-124的表達豐度影響鼻咽癌細胞遷移與侵襲能力。

2.5 MIAT通過miR-124調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路Western blot分析結(jié)果顯示，抑制MIAT表達時，β-catenin、cyclin D1、c-Myc表達水平下調(diào)（P ＜0.05）。與對照組（si-MIAT+inhibitor NC）相比，轉(zhuǎn)染組（si-MIAT+miR-124 inhibitor）中β-catenin、cyclin D1、c-Myc表達水平顯著提升（P＜0.05）。見圖5。這表明抑制miR-124的表達能提高β-catenin、cyclin D1、c-Myc表達水平，可見MIAT下調(diào)miR-124的表達豐度進而提高Wnt/β-catenin信號通路表達。

圖2 MIAT與miR-124的關(guān)系

圖3 si-MIAT抑制HONE-1細胞增殖

3 討論

LncRNA已被證實在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MIAT參與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展，如慢性淋巴細胞白血病、肺腺癌和前列腺癌[16-19]。有研究報道MIAT的高表達促進胃癌的發(fā)展，其可能在人胃癌中發(fā)揮致癌作用[21]。此外，研究者通過分析乳腺癌組織的基因表達水平，證實MIAT表達水平提高增加了乳腺癌患病風險，特別是在疾病的早期階段（階段I和II），這表明在乳腺腫瘤形成早期階段MIAT過表達很重要，其可能在惡性腫瘤的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[22]。然而，MIAT在鼻咽癌中的作用與調(diào)節(jié)機制尚未見報道。為探討MIAT在鼻咽癌中的生物學功能，本研究對其表達水平進行了分析。我們的數(shù)據(jù)顯示，與正常鼻咽上皮細胞相比，鼻咽癌細胞中MIAT表達水平上調(diào)。

miRNA是一類內(nèi)源性的、高度保守的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于植物和多細胞動物的基因組中[7]。近年來，許多研究表明miRNA參與肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌細胞的增殖、遷移與侵襲等過程，調(diào)控miRNA的表達豐度能抑制腫瘤發(fā)展[23-25]。此外，lncRNA可以作為競爭性內(nèi)源性RNA，通過序列互補來吸收miRNA，進而影響miRNA的生物學功能。LI等[26]發(fā)現(xiàn)MALAT1通過在肺癌細胞中與miR-124結(jié)合，激活MAPK信號通路。本研究通過生物信息學分析顯示MIAT可能與miR-124相結(jié)合，并通過使用熒光素酶報告分析證明MIAT含有miR-124結(jié)合位點?，F(xiàn)有研究表明，miR-124的表達豐度可能影響肝癌、肺癌等腫瘤的增殖過程[11，27-29]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-124通過抑制Wnt/β-catenin信號通路參與鼻咽癌細胞增殖和遷移[30]。本研究中MTT實驗結(jié)果顯示干擾MIAT表達能抑制鼻咽癌細胞的增殖能力，而轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor后發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞的增殖能力在一定程度得到提高，其可能在鼻咽癌細胞中充當miR-124的分子海綿。miR-124被認為是癌癥發(fā)展中的抑癌因子，其可以抑制鼻咽癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。因此，MIAT通過負調(diào)控miR-124的表達對人鼻咽癌產(chǎn)生致癌作用。

先前的研究已證實miR-124可抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲[30]。本研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)MIAT可抵消miR-124對Wnt/β-catenin的抑制作用。這些結(jié)果表明，MIAT通過靶向miR-124調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路。

綜上所述，本研究表明MIAT通過調(diào)節(jié)miR-124而進一步調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，促進鼻咽癌細胞的增殖和侵襲。MIAT水平的調(diào)控可能為未來鼻咽癌患者提供一種新的治療方法。

圖4 MIAT通過miR-124調(diào)節(jié)HONE-1細胞遷移和侵襲

圖5 MIAT通過miR-124調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路