余丹揚(yáng)，梁宗文，徐超逸，顏林志，陳楓，朱家瑋，段萍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

在生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，卵巢癌是女性的首要致死原因，有研究顯示女性因卵巢癌而病死的人數(shù)占總癌癥病死數(shù)的6%[1]。卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是卵巢癌的主要組織學(xué)類型之一，它又分為漿液性、黏液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞腺癌4種亞型。75%～80%的卵巢癌為卵巢漿液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocar-cinoma，OSC），預(yù)后極差[2-3]。鑒于OSC患者的5年存活率極低（約30%），識(shí)別新的預(yù)后指標(biāo)，為患者提供早期有效的治療是我們的新目標(biāo)[4]。

miRNA是一種約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種重要細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控[5-6]。但miR-631在EOC中的作用尚未見報(bào)道。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取570例卵巢癌患者的臨床病理信息和相應(yīng)的miR-631的表達(dá)量，分析miR-631的表達(dá)量與EOC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，并探討miR-631對(duì)EOC細(xì)胞遷移的作用及對(duì)裸鼠成瘤體積的影響，探討miR-631表達(dá)水平與EOC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、動(dòng)物、試劑的來源:人卵巢癌細(xì)胞株ES2、A2780、COV504、SKOV3均來自中山大學(xué)腫瘤防治中心、華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，RPMI1640培養(yǎng)基、DMED培養(yǎng)基、胎牛血清均購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。miR-631類似物（miR-631 mimic）及其陰性對(duì)照藥品（mimic NC）、miR-631抑制物（miR-631 inhibitor）及其陰性對(duì)照藥品（inhibitor NC）均購于廣州瑞博生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2 000脂質(zhì)體試劑盒購于北京英格恩生物科技有限公司，BALB/C-nu/nu裸小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào):SYXK（京）2017-0033]。

1.1.2 從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得數(shù)據(jù):2018年11月從癌癥和腫瘤基因圖譜（Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（http://www.firebrowse.org/）中提取570例EOC患者的臨床資料及其相應(yīng)miRNA序列表達(dá)數(shù)據(jù)。收集的臨床病理及生存數(shù)據(jù)包括:年齡、人種、腫瘤分級(jí)、臨床分期、腫瘤分布位置、腫瘤壞死情況、淋巴浸潤(rùn)、血管侵襲等情況，以及患者的生存狀態(tài)和總生存時(shí)間。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 EOC細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng):挑選miR-631低表達(dá)的EOC細(xì)胞株A2780、COV504和miR-631高表達(dá)的細(xì)胞株ES2和SKOV3。嚴(yán)格參照Lipofectamine 2 000脂質(zhì)體試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別將miR-631 mimic及mimic NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞株A2780和COV504，miR-631 inhibitor及inhibitor NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞株ES2 和SKOV3。A2780細(xì)胞用含10% FBS的DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)，ES2、SKOV3、COV504細(xì)胞用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均于37 ℃，5% CO2的濕化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞遷移能力測(cè)定:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于前1天換為無血清培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)12～24 h。次日消化離心后用PBS洗滌1～2 遍，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。向transwell小室上層加入5×104～1×105個(gè)細(xì)胞，補(bǔ)足其體積至200 μL；下層加入700 μL含10%～20% FBS的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h；取出transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS洗2遍，甲醇固定15 min后，PBS洗2遍；結(jié)晶紫染色15～20 min，用清水洗滌至無結(jié)晶紫殘留；拭去上室殘留細(xì)胞置于顯微鏡高背景視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

1.3.1 接種前細(xì)胞培養(yǎng):實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為2組，分別為miR-631類似物組與對(duì)照組，miR-631類似物組為轉(zhuǎn)染miR-631 mimic的A2780細(xì)胞株，對(duì)照組為轉(zhuǎn)染mimic NC的A2780細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)接種細(xì)胞。待細(xì)胞足夠后，消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整其終濃度為1×107/mL。把細(xì)胞置于冰上，準(zhǔn)備接種裸鼠。

1.3.2 裸鼠皮下種植:BALB/C-nu/nu裸小鼠10只，4～6周，隨機(jī)平均分成2組，分別為miR-631類似物組和對(duì)照組，miR-631類似物組裸鼠接種轉(zhuǎn)染miR-631類似物的A2780細(xì)胞株，對(duì)照組裸鼠接種轉(zhuǎn)染miR-631類似物陰性對(duì)照藥品的A2780細(xì)胞株，接種細(xì)胞前應(yīng)充分重懸混勻細(xì)胞，用1 mL注射器吸取細(xì)胞懸浮液，在右側(cè)背部偏后側(cè)皮下接種1×106個(gè)細(xì)胞/只，即每只100 μL。

1.3.3 觀察裸鼠成瘤情況:種植7 d后開始觀察裸鼠成瘤情況，皮下瘤長(zhǎng)至一定體積后，完整分離每只裸鼠的腫瘤，記錄及拍照。拍照結(jié)束后一部分皮下瘤組織置于-80 ℃冰箱中，以待以后用于提取組織蛋白以及RNA；另一部分皮下瘤組織用4%中性甲醛固定組織，并委托病理科浸蠟包埋后切片。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有裸鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后頸椎脫臼安樂死。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)該TCGA隊(duì)列EOC患者的生存情況及miR-631表達(dá)量，采用X-tile軟件（美國耶魯大學(xué)）獲得該隊(duì)列的最佳截?cái)嘀?。利用獲得的最佳截?cái)嘀?，將納入的EOC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組?？偵鏁r(shí)間主要定義為從確診到死亡或最后一次隨訪的時(shí)間跨度。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)2組變量的分布差異。繪制Kaplan-Meier曲線，比較miR-631高表達(dá)組與miR-631低表達(dá)組的生存差異；采用Mantel-COX對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)來計(jì)算P值。EOC患者預(yù)后影響因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型。所有生存相關(guān)曲線均使用GraphPad Prism 7繪制。2組定量資料比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或者配對(duì)t 檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌患者的臨床特點(diǎn)

從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取卵巢癌患者信息，其中包括570例EOC患者的臨床病理信息和相應(yīng)的miR-631的表達(dá)量。患者年齡為59（26～90）歲。X-tile軟件分析顯示miR-631表達(dá)的最佳截?cái)嘀禐?.78，并將患者分為miR-631低表達(dá)組（miR-631相對(duì)表達(dá)量＜4.78）和miR-631高表達(dá)組（miR-631相對(duì)表達(dá)量≥4.78）。見圖1。2組間臨床病理學(xué)特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（數(shù)據(jù)文中未顯示）。

2.2 miR-631表達(dá)的預(yù)后意義

miR-631低表達(dá)組EOC患者OS明顯差于miR-631高表達(dá)組（HR=1.55，95%CI=1.12～2.14，P=0.008），見圖2。隨后，使用單因素及多因素COX回歸分析來評(píng)價(jià)miR-631表達(dá)的影響和其他臨床病理因素對(duì)EOC患者的影響（見表1）。在多因素COX回歸分析中，我們發(fā)現(xiàn)miR-631的低表達(dá)是影響EOC患者OS下降的獨(dú)立因素（HR=1.39，95%CI=1.03～1.87，P=0.029）。年齡、殘余腫瘤大小及臨床分期與OCS患者預(yù)后也有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。

2.3 miR-631抑制EOC細(xì)胞的遷移

圖2 miR-631高表達(dá)組和低表達(dá)組EOC患者的生存曲線圖

我們選擇了2種miR-631低表達(dá)的EOC細(xì)胞株:A2780、COV504，發(fā)現(xiàn)在這2種細(xì)胞株中，增加miR-631的表達(dá)明顯地降低了細(xì)胞的遷移能力（見圖3）。相反的，我們選擇了2種miR-631高表達(dá)的EOC細(xì)胞株:ES2、SKOV3，發(fā)現(xiàn)在ES2細(xì)胞株中，與對(duì)照組相比，下調(diào)miR-631的表達(dá)可以顯著地提高細(xì)胞的遷移能力；在SKOV3細(xì)胞株中我們觀察到了相似地結(jié)果（見圖4）。

表1 570例卵巢癌患者miR-631的表達(dá)與臨床特征的COX回歸分析

2.4 在EOC裸鼠模型中miR-631減小腫瘤體積

我們選擇了miR-631低表達(dá)的A2780細(xì)胞株建立EOC裸鼠皮下模型，發(fā)現(xiàn)在活體模型中，上調(diào)miR-631的表達(dá)可以減小腫瘤體積（見圖5）。

3 討論

EOC占所有卵巢癌的85%～90%[7]。每年全世界有超過220 000名女性被診斷患有EOC[8]。但是，由于缺乏有效的篩查策略，近70%的EOC患者被診斷為晚期，而晚期患者的5年總生存率仍然停滯不前，大約40%[9]。此外，晚期EOC患者易于復(fù)發(fā)并且對(duì)化療耐藥[8]。因此，迫切需要確定一些生物標(biāo)志物，以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后及術(shù)前治療的個(gè)人指導(dǎo)[10]。

圖3 miR-631類似物抑制EOC細(xì)胞株A2780、COV504的遷移能力

圖4 miR-631抑制物促進(jìn)EOC細(xì)胞株ES2、SKOV3的遷移能力

圖5 2組EOC裸鼠模型腫瘤體積的變化

近年的研究表明，miRNAs表達(dá)失調(diào)已成為各種腫瘤共有的特征，其作為一類新的分子研究靶點(diǎn)用于腫瘤的診斷和治療，已倍受腫瘤界的關(guān)注[11-13]。而miRNA是一種大小為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，作為基因表達(dá)調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種重要細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控[14]。許多研究報(bào)道了一系列miRNA，如:miR-181a、miR-34a、miR-211、miR-199a-3p、miR-193b、miR-338-3p、miR-200、miR-141、miR-145等表達(dá)失調(diào)與EOC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15-23]。YU等[24]發(fā)現(xiàn)miR-631可以通過調(diào)節(jié)磺基轉(zhuǎn)移酶亞基1A1（SULT1A1）而影響酶的活性；XI等[25]研究表明miR-631/UbcH10/MDR1通路與骨髓瘤細(xì)胞中硼替佐米耐藥的發(fā)展密切相關(guān)，miR-631的過表達(dá)可顯著提高耐藥性骨髓瘤細(xì)胞的硼替佐米敏感性。但miR-631在EOC中的作用尚未見報(bào)道。

在本研究中，我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫提取570例EOC患者的臨床病理信息和相應(yīng)的miR-631的表達(dá)量，識(shí)別miR-631在EOC患者中的臨床意義。生存分析結(jié)果顯示，miR-631低表達(dá)的EOC患者總生存率較miR-631高表達(dá)的患者短。隨后的單變量和多變量COX回歸分析也表明，miR-631是EOC患者預(yù)后較差的獨(dú)立因素。以上結(jié)果表明，miR-631的低表達(dá)可能與EOC患者預(yù)后較差有關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-631與EOC預(yù)后的關(guān)系，利用Transwell試驗(yàn)，檢測(cè)miR-631對(duì)卵巢癌細(xì)胞株的遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-631表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移，而下調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移。為了更深入地研究miR-631對(duì)EOC預(yù)后的影響，我們建立了EOC動(dòng)物模型，在EOC裸鼠模型中我們發(fā)現(xiàn)增加miR-631的表達(dá)量可以顯著減小腫瘤的體積，對(duì)EOC起抑制作用。

綜上所述，我們得出miR-631的低表達(dá)與EOC患者預(yù)后較差有關(guān)。在將來，miR-631有可能可以作為一個(gè)預(yù)測(cè)EOC預(yù)后的有效靶點(diǎn)，為EOC患者的治療提供指導(dǎo)。