黃崇杰，曹偉蘭，洪滉，劉鵬鵬，劉長寶

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 甲乳外科，浙江 麗水 323000）

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球各腫瘤中位居第三，且有逐年升高的趨勢[1]。結(jié)直腸黏液腺癌占大腸癌病例的10%～15%，易發(fā)生腹膜種植轉(zhuǎn)移，對化療的反應(yīng)較差，所以根治切除率低，預(yù)后差[2]。目前關(guān)于腹膜種植轉(zhuǎn)移的機制尚不十分清楚，TGF-β是一種多功能的多肽類細胞因子，TGF-β1是其中一種亞型，大量研究發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌、胃癌、大腸癌中的表達量明顯升高，且與腫瘤的預(yù)后較差直接相關(guān)[3-5]。miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，一直是近幾年來腫瘤研究的熱點，let-7家族是第2個被發(fā)現(xiàn)的miRNA分子，而let-7a基因的下調(diào)已被公認為大腸癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵事件，且已被證實是一個抑癌基因，其中c-myc、RAS和HMGA2為let-7的下游靶基因。最新研究表明它可以調(diào)控TGF-β1信號通路，影響細胞增殖和分化[6]，但對黏液腺癌腹膜轉(zhuǎn)移方面的研究尚未見報道。本研究通過慢病毒載體介導攜帶人let-7a基因?qū)肴私Y(jié)腸黏液腺癌LS-174T細胞，上調(diào)1et-7a基因的表達，通過體外實驗，觀察其對腫瘤的生長抑制作用、侵襲轉(zhuǎn)移及TGF-β1蛋白表達的影響，從而探討其與結(jié)腸黏液腺癌腹膜轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要材料人結(jié)腸黏液腺癌細胞LS-174T購自中國科學院上海分院，let-7a過表達慢病毒載體系統(tǒng)由上海吉凱基因科技有限公司構(gòu)建完成，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清購買自杭州四季青公司，兔抗人Anti-TGF-β1多克隆抗體，山羊Anti-Rabbit IgG購自英國Abcam公司，RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大MBI fermentas公司，Real-time試劑盒購自日本Toyobo公司，RNA提取液TRIzol購自美國Invitrogen公司，RT-qPCR引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染:①結(jié)腸黏液腺癌LS-174T細胞分為5組:空白對照組（A組，不進行病毒轉(zhuǎn)染）；轉(zhuǎn)染空病毒組（B組，只含有EGFP，濃度1×107TU/L）；C1轉(zhuǎn)染組（C1組，濃度1×106TU/L）:轉(zhuǎn)染hsa-Let-7a（含let-7a病毒和EGFP）；C2轉(zhuǎn)染組（C2組，濃度1×107TU/L）:轉(zhuǎn)染hsa-Let-7a（含let-7a病毒和EGFP）；C3轉(zhuǎn)染組（C3組，濃度1×108TU/L）:轉(zhuǎn)染hsa-Let-7a（含let-7a病毒和EGFP）。②0.25%胰蛋白酶消化細胞后，配制成密度為2.0×105/mL的細胞懸液種植于24孔板中。待細胞匯合度達到50%～60%時進行病毒轉(zhuǎn)染，按3個不同的MOI值（MOI=1、10、100）計算所需病毒量，用Eni.S稀釋得到所需滴度。用培養(yǎng)基稀釋Polybrane使終濃度為5 μg/mL。病毒液、Polybrane、完全培養(yǎng)基按一定的比例配制，調(diào)整每孔總量為500 μL，加入標記好的各孔。培養(yǎng)12 h后進行換液，48 h后使用熒光顯微鏡觀察細胞生長狀況及綠熒光表達情況。

1.2.2 MTT實驗:將上述5組細胞接種于96孔板，每組設(shè)8個復(fù)孔，同時設(shè)調(diào)零孔。分別于12、24、48、72、96 h各時點取一板，向所對應(yīng)孔中各加入20 μL配好的MTT溶液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，避光搖床上振蕩10 min，使其充分混勻。酶標儀上選擇570 nm波長，檢測各孔的OD值，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制LS-174T細胞生長曲線，并做相關(guān)統(tǒng)計學檢測。

1.2.3 RT-qPCR檢測let-7a及TGF-β1 mRNA表達水平:將各組貼壁細胞消化離心后，裂解，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，采用SYBR Green嵌合熒光定量PCR法（按照日本Toyobo公司的RT-qPCR試劑盒說明書操作），以β-actin為內(nèi)參檢測細胞的TGF-β1含量，以U6為內(nèi)參檢測細胞let-7a的含量，引物序列見表1。mRNA相對定量的計算方法:首先用RT-qPCR得到的目的基因Ct值分別與其相對應(yīng)的內(nèi)參的Ct值相減進行校正，得到目的基因的校正Ct值（ΔCt），再以空白對照組中的平均校正Ct值作為本底參數(shù)，則目的基因的量:每個實驗重復(fù)3次取平均值。

表1 各目的基因及內(nèi)參引物序列

1.2.4 Western blot檢測TGF-β1 蛋白表達水平:將轉(zhuǎn)染后的各組細胞溫箱培養(yǎng)48 h后，消化裂解收集細胞并在4 ℃以12 000 r/min離心10 min。收集總蛋白質(zhì)，并通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將處理過的蛋白質(zhì)樣品進行電泳電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用TBST緩沖液洗滌后，用5%脫脂乳將印跡完全封閉2 h，與TGF-β1和β-actin內(nèi)參抗體孵育。在4 ℃的振蕩器上過夜。將膜用TBST洗滌3次，并與HRP標記的山羊抗兔二抗孵育2 h。將膜洗滌3次，并用ECL試劑盒顯現(xiàn)反應(yīng)條帶。使用Gel Image System ver分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 細胞侵襲實驗:取Transwell小室置于24孔板后水化基質(zhì)膠，在下室中加入500 μL含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基，將LS-174T細胞胰酶消化后，予無血清培養(yǎng)基對其混勻重懸5×105的細胞密度，取100 μL接種在24孔板的上室中。置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱，孵育24 h，取出小室，吸掉培養(yǎng)液后用棉簽拭去上室內(nèi)未穿過基底層膜的細胞。將小室置于無水甲醇中固定20 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，沖洗，晾干后倒置顯微鏡對Transwell小室隨機取10個不同視野進行拍照保存，計算平均值進行統(tǒng)計分析，繪制統(tǒng)計圖。

1.2.6 劃痕實驗:將LS-174T細胞以每孔5×105個細胞接種在6孔板中。溫室培養(yǎng)待細胞長滿70%～80%后，予無血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理12 h。通過用無菌移液管尖端進行垂直劃痕并用PBS除去脫落的細胞來模擬傷口。細胞在37 ℃的恒溫下培養(yǎng)。36 h后測量。

1.3 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 各組細胞轉(zhuǎn)染慢病毒48 h后倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達情況（×40）

2 結(jié)果

2.1 倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞轉(zhuǎn)染效果各組細胞48 h綠色熒光表達情況見圖1，C3組熒光表達最強，感染效率可達90%以上，與初始病毒濃度成正相關(guān)（P＜0.05）。

2.2 MTT法檢測各組細胞增殖活力各組OD值均隨時間延長而增高，第1天，5組OD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），第2、第3、第4天，與A組比，C組的OD值增幅明顯降低（P＜0.05），B組OD值與A組比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明let-7a對細胞增殖活力有明顯抑制作用，且let-7a含量越高對細胞增殖抑制作用越強，空病毒對細胞增殖無明顯影響。見圖2。

2.3 RT-qPCR檢測各組細胞let-7a及TGF-β1 mRNA表達水平與A組比較，C組細胞let-7a的表達水平均上調(diào)；C組之間細胞let-7a的表達水平隨著病毒濃度的升高而逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而B組let-7a的表達水平相與A組比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與A組比，C組TGF-β1 mRNA表達水平下調(diào)，且與C組間病毒濃度呈負相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而B組TGF-β1 mRNA表達水平較A組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 Western blot檢測TGF-β1蛋白表達水平C組細胞TGF-β1表達水平較A組降低（P＜0.05）；B組與A組TGF-β1表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖2 各組細胞生長曲線

圖3 各組細胞中l(wèi)et-7a和TGF-β1 mRNA的表達水平

圖4 各組細胞TGF-β1蛋白相對表達量

2.5 Transwell侵襲實驗檢測各組細胞侵襲能力C組細胞穿過濾膜數(shù)較A組均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），且轉(zhuǎn)染含let-7a慢病毒濃度越高穿過濾膜細胞數(shù)越少；A組與B組比，細胞穿過濾膜數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

2.6 劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力C組細胞劃痕愈合率較A組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A組與B組比，細胞劃痕愈合率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

3 討論

大腸黏液腺癌是一組起源于結(jié)直腸上皮組織，以黏液分泌異?？哼M為特征的惡性腫瘤，因其易浸潤突破漿膜層和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，容易發(fā)生腹膜種植轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。目前關(guān)于腹膜種植轉(zhuǎn)移的機制尚不十分清楚，目前的研究主要集中在癌細胞自身和腹膜的解剖生理功能及分子生物學機制，包括種子-土壤學說、乳斑學說。TGF是一種多功能的多肽類細胞因子，其中包括TGF-β、活性素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長分化因子等[7]，它們的氨基酸序列具有不同程度的同源性，其中TGF-β是一個相對分子質(zhì)量約為25 kDa的二聚體分子，有5個亞型（l～5），其中TGF-βl發(fā)揮最主要的作用，它可通過自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)細胞活動，參與多種病理生理過程，對細胞的生長、分化、黏附、侵襲及細胞外基質(zhì)的形成具有重要作用[8]。研究表明TGF-β可通過誘導腹膜纖維化，為種植轉(zhuǎn)移提供良好的土壤，誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)黏附相關(guān)分子、金屬蛋白酶的表達從而促進細胞發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移[9-10]。所以我們認為通過調(diào)控TGF-β1信號通路可以抑制大腸黏液腺癌腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。

圖5 Transwell顯示各組細胞遷移能力

圖6 劃痕實驗顯示各組細胞劃痕愈合率（×40）

近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，let-7a基因的下調(diào)已被公認為大腸癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵事件，且已被證實是一個抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)它可通過調(diào)控c-myc、RAS和HMGA2下游靶基因抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡[11]，AKAO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，let-7a在結(jié)腸癌組織和細胞株中表達水平都有所下降，當用let-7a-1轉(zhuǎn)染DLD-1結(jié)腸癌細胞株后，結(jié)腸癌細胞受到了明顯的生長抑制，并且還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后，Ras和c-myc蛋白的表達水平明顯下降。本研究通過慢病毒載體介導攜帶人let-7a基因?qū)肴私Y(jié)腸黏液腺癌LS-174T細胞，熒光倒置顯微鏡觀察各組細胞48 h后綠色熒光表達情況，C3 感染組熒光表達最強，感染效率可達90%以上，與初始病毒濃度成正相關(guān)，表明慢病毒載體介導let-7a能成功、高效轉(zhuǎn)導入人結(jié)腸癌LS-174T細胞。MTT檢測結(jié)果顯示各組OD值均隨時間延長而增高，在第1天，5組OD值無明顯差異，第2、第3、第4天，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染組的OD值增幅明顯降低，說明let-7a過表達對細胞增殖活力有明顯抑制作用，且let-7a含量越高對細胞增殖抑制作用越強，空病毒對細胞增殖無明顯影響。熒光定量PCR檢測各組細胞let-7a mRNA表達水平，結(jié)果顯示與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組let-7a mRNA的表達水平顯著升高，且轉(zhuǎn)染細胞let-7a的表達水平與含let-7a的慢病毒濃度梯度呈正相關(guān)，陰性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組表達水平無明顯差異，實現(xiàn)了細胞內(nèi)let-7a不同表達水平的干預(yù)。進一步結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7a高表達組即轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力、遷移能力較未轉(zhuǎn)染組降低，且let-7a濃度越高降低程度越明顯，未轉(zhuǎn)染組與陰性對照組細胞增殖能力、遷移能力、侵襲能力無明顯差異，表明上調(diào)let-7a表達水平對LS-174T細胞增殖能力、遷移能力、侵襲能力有抑制作用，而空病毒對LS-174T細胞增殖及遷移侵襲能力無明顯影響。通過Western blot和RT-qPCR檢測TGF-β1蛋白及mRNA的表達水平，轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)TGF-β1 mRNA及蛋白表達水平較未轉(zhuǎn)染組均呈明顯下降趨勢，未轉(zhuǎn)染組與陰性轉(zhuǎn)染組無明顯差異。TGF-β1表達水平同let-7a表達水平呈負相關(guān)，進而推測上調(diào)let-7a可能是通過下調(diào)TGF-β1表達水平而發(fā)揮抑制LS-174T細胞增殖活性及遷移侵襲能力，可能影響結(jié)腸癌腹膜種植轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究初步探索了let-7a和TGF-β1在LS-174T細胞增殖、遷移及侵襲中的作用及其可能作用機制，結(jié)合實驗結(jié)果，我們可以推測過表達的let-7a可明顯抑制細胞生長，可能通過TGF-β信號通路，抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，從而抑制大腸黏液腺癌腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展，但其具體分子通路、各個通路之間相互作用需進一步深入研究。