蒲小蘭　吳煒　林書蘭　王曉玉　王娃金

【摘 ?要】采用聚酰胺柱層析法分離總黃酮，紫外分光光度法檢測(cè)椰島牌海王酒中的總黃酮。將酒樣加聚酰胺吸附，水浴揮干乙醇，轉(zhuǎn)入層析柱，用甲醇洗脫黃酮，在波長(zhǎng)360nm處測(cè)定其含量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍在30?g/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%，加標(biāo)回收率在97～102之間。結(jié)果表明，本檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好。

【關(guān)鍵詞】總黃酮;保健酒;聚酰胺柱層析;紫外分光光度法

【中圖分類號(hào)】R151 ? ? ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? ? ?【文章編號(hào)】1004-7484（2020）09-0270-02

1材料與方法

1.1儀器

島津UV—1800型紫外分光光度計(jì);十萬分之一天平（Sartorius BP211D）;千分之一天平（上海恒平電子天平 JA5003）;超聲波洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州奧化儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000）;層析柱（1.5 × 50cm）、容量瓶（10 mL，25 mL，50 mL）、移液管（1mL，2 mL，5 mL）、蒸發(fā)皿、脫脂棉花。

1.2試劑

除非另有說明，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的三級(jí)水。

蘆丁對(duì)照品（含量92.5%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)100080 - 200707），供UV法檢查用;聚酰胺（80～100目，柱層析FCC，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;乙醇（95%，廣東光華科技股份有限公司）;氫氧化鈉（廣東光華科技股份有限公司）;冰醋酸（西隴化工股份有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取在103+1℃下干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品2.50mg至50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL含有46.25μg（按92.5%折算）的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精密吸取該蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.0mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，于360nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，求回歸方程，用以計(jì)算試樣中總黃酮含量。

1.3.2樣品的制備

1.3.2.1聚酰胺的預(yù)處理

購(gòu)買的聚酰胺先用80目不銹鋼篩子篩除大于80目的部分，然后用100目不銹鋼篩子篩除小于100目的部分，取80～100的聚酰胺，用適量90%～95%乙醇浸泡聚酰胺，不斷攪拌，除去氣泡后裝入層析柱中。用3～4倍體積的90%～95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘?jiān)ɑ驑O少殘?jiān)?，然后用水洗脫至無醇味。再依次用2～2.5倍體積的5%NaOH溶液，1倍體積的水，2～2.5倍體積的10% 醋酸溶液洗脫，最后用蒸餾水洗至流出液pH為中性;最后將處理好的聚酰胺置于60 ℃烘干，備用。

供試品溶液的制備

準(zhǔn)確吸取2mL保健酒樣于蒸發(fā)皿中，加入1.5g經(jīng)過預(yù)處理的聚酰胺粉（80～100目）吸附，于水浴70 ℃揮干溶劑，轉(zhuǎn)入層析柱中，用50 mL甲醇洗脫（流速為2～3s/d），洗脫液減壓濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

1.3.3樣品含量的測(cè)定

取上述供試品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在360nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算試樣中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1聚酰胺預(yù)處理必要性的考察

分別吸取2 mL酒樣 6份于6個(gè)蒸發(fā)皿，分為兩組，每組3份，一組加入1.5g處理過的聚酰胺粉（30～60目），另一組加入1.5g未經(jīng)處理的聚酰胺粉（30～60目）進(jìn)行吸附，于水浴70 ℃揮干溶劑，然后轉(zhuǎn)入層析柱中。先用40 mL苯洗，洗脫液棄去，再用50 mL甲醇洗脫，洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用甲醇定容。于360 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。結(jié)果見表1

經(jīng)成組雙側(cè)t檢驗(yàn)，t= 15.584，t > t（0.05，4）=2.776，P < 0.05，即聚酰胺的處理與否對(duì)總黃酮含量測(cè)定結(jié)果有顯著性影響，故市售聚酰胺需經(jīng)過預(yù)處理才能用于供試品溶液的制備。

2.2聚酰胺粒徑的篩選

準(zhǔn)確吸取2mL酒樣于蒸發(fā)皿中，加不同粒徑的聚酰胺粉1.5g吸附，于70℃揮干溶劑，然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用50 mL甲醇洗脫，洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容。于360 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。重復(fù)3次，結(jié)果見表2。

由表4可以發(fā)現(xiàn)，聚酰胺的粒徑對(duì)總黃酮含量測(cè)定結(jié)果有顯著性影響，粒徑為80～100目的分離富集效果最佳，因此，選擇粒徑為80～100目的聚酰胺進(jìn)行柱層析。

2.3樣品預(yù)處理必要性的考察

量取一定量酒樣于25 mL容量瓶中，超聲20 min，靜置。吸取2mL于蒸發(fā)皿中，加1.5g聚酰胺粉（30～60目）吸附，于水浴70℃揮干，然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用50 mL甲醇洗脫，洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，重復(fù)制備樣品3份。另取3份樣品，不經(jīng)超聲預(yù)處理，直接上樣，按上述方法處理，于360 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，結(jié)果如表3所示。

經(jīng)成對(duì)資料雙側(cè)t檢驗(yàn)，t = 3.051，t < t（0.05，2）=4.303，P > 0.05，即樣品超聲與未超聲測(cè)定的吸光度無明顯差異。所以，取樣時(shí)不需要經(jīng)過超聲處理。

2.4樣品取樣量的篩選

分別量取一定量的酒樣，用乙醇稀釋不同的倍數(shù)，準(zhǔn)確吸取一定的量，加入聚酰胺（30～60目）進(jìn)行吸附，于水浴70℃揮干，然后轉(zhuǎn)入層析柱中，采用不同體積的甲醇洗脫，洗脫液濃縮，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用甲醇定容，測(cè)定吸光值。樣品取樣量，稀釋倍數(shù)，聚酰胺用量，甲醇用量，最終定容體積及吸光值見表4

由表中的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，樣品不稀釋直接進(jìn)行聚酰胺柱層析，可以達(dá)到紫外-可見風(fēng)光光度法對(duì)吸光值在0.3～0.7范圍內(nèi)的要求，考慮到供試品溶液制備過程中試劑、試藥的用量及批量檢測(cè)的效率，取樣量定為2 mL，最終定容體積為25 mL，其它參數(shù)另外考察。

2.5樣品取樣量與聚酰胺用量之間關(guān)系的考察

準(zhǔn)確吸取樣品溶液B（2） 2mL于蒸發(fā)皿中，加不同比例地聚酰胺粉吸附，于水浴70℃揮干，然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用50 mL甲醇洗脫，洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容。于360 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。重復(fù)3次。另取1g和2g聚酰胺各三份，按上述方法處理。結(jié)果見表5

由表5可以看出，聚酰胺用量為1g和1.5g，檢測(cè)的吸光值均大于用量為2.0g的吸光值，用量為1g和1.5g的吸光值無差異，但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，采用1g聚酰胺吸附時(shí)，易出現(xiàn)黏附在蒸發(fā)皿的現(xiàn)象，因此，設(shè)定聚酰胺的用量為1.5 g。

2.6水浴溫度的考察

分別量取樣品B（2） 2 mL于不同的蒸發(fā)皿中，加入1.5 g 聚酰胺吸附，于水浴上（設(shè)置不同的水浴溫度見表6）揮干，然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用50 mL甲醇洗脫，洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用甲醇定容。于360nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。每個(gè)溫度重復(fù)制備3份，對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，見表7

由表7可以發(fā)現(xiàn)，設(shè)定的水浴溫度對(duì)總黃酮含量測(cè)定結(jié)果無顯著性影響，當(dāng)水浴溫度為70℃時(shí)，水浴揮干時(shí)間約30 min，有利于操作。因此，設(shè)定水浴溫度為70℃。

2.7除雜劑的篩選

分別吸取2mL樣品B（2）于蒸發(fā)皿中，加1.5g聚酰胺粉吸附，于水浴70℃揮干，然后轉(zhuǎn)入層析柱中。方法一：先用20 mL苯洗，洗脫液棄去，再用50 mL甲醇洗脫;方法二：先用20mL 石油醚洗脫，洗脫液棄去，再用50 mL甲醇洗脫;方法三： 直接用50 mL甲醇洗脫。洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，于360nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。每種除雜劑平行制備樣品3份。結(jié)果如表8所示。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析t 檢驗(yàn)，苯洗脫與不除雜之間的t為0.711， 苯洗脫與石油醚洗脫的t為1.650，t0.05，所以，樣品除雜與不除雜，對(duì)總黃酮的含量測(cè)定無顯著性差異，考慮對(duì)操作者的環(huán)保及勞動(dòng)保護(hù)，因此，供試液制備不經(jīng)除雜劑洗脫。

2.8洗脫劑用量的考察

準(zhǔn)確吸取2mL樣品B（2）于蒸發(fā)皿中，加1.5g聚酰胺粉吸附，于水浴70℃揮干，然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用甲醇洗脫，每10 mL收集一次，對(duì)洗脫液進(jìn)行Alcl3反應(yīng)，同時(shí)于波長(zhǎng)360 nm處測(cè)定每一瓶洗脫液的吸光值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：洗脫至30 mL，Alcl3反應(yīng)結(jié)果幾乎為陰性，洗脫曲線表明當(dāng)洗脫體積為45 mL 時(shí)，洗脫完全。洗脫曲線見圖1

為了確定最終洗脫體積，我們?cè)O(shè)選取了45 mL前后的3個(gè)體積（40、50、60mL）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表9所示，

由表9可以看出當(dāng)洗脫劑甲醇的用量達(dá)到50 mL時(shí)，樣品中總黃酮能夠被洗脫完全。因此，設(shè)定甲醇的洗脫體積為50 mL。

2.9洗脫流速的考察

分別準(zhǔn)確吸取樣品B（2）2mL于不同的蒸發(fā)皿中，加入1.5g聚酰胺吸附，于水浴70℃揮干，然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用甲醇50 mL洗脫，設(shè)置不同的流速（見表10），洗脫液減壓濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，此液在360 nm處測(cè)定吸光度，對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)行F 檢驗(yàn)，結(jié)果見11.

由方差分析結(jié)果可以看出，洗脫流速對(duì)含量測(cè)定結(jié)果有顯著性影響，我們對(duì)5種流速進(jìn)行了兩兩比較，進(jìn)行q檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的流速組有差別，其中流速為2-3 s/d 結(jié)果最好，因此，柱層析流速為2-3 s/d。

2.10檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.83g（含量92.5%）至50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為52.355?g/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。以此溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在360 nm處有最大吸收，因此選擇360 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。圖譜如圖2

2.11標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

分別準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（52.355μg/mL）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。于波長(zhǎng)360 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（?g/mL）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0316x-0.0024，r=0.99995，數(shù)據(jù)見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由試驗(yàn)結(jié)果可知，蘆丁在5.2355 ～26.1775?g/mL范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系。

2.12方法的檢出限

2.12.1檢出限和定量限的確定

把3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量作為檢出限。其中吸光法的檢出限L = 3 s/b。s 為空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率。20次全試劑空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0079，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率為0.0316，由此計(jì)算出該方法的檢出限為0.75?g。

2.12.2檢出限的驗(yàn)證

直接取0.5mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（52.355?g/mL）至25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得濃度為1.0471?g/mL的溶液，于360nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為0.03445，根據(jù)回歸方程y=0.0316x-0.0024計(jì)算濃度為1.1519?g/mL，說明該方法檢出限設(shè)置合理。

2.13精密度試驗(yàn)

取一份B（2）樣品，按“3檢測(cè)方法”所述方法處理，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.14重復(fù)性試驗(yàn)

取編號(hào)為B（2）的樣品，按“3檢測(cè)方法”所述方法處理，平行處理制備6份，分別測(cè)定吸光度，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.15穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一份B（2）樣品，按“3檢測(cè)方法”所述方法處理，樣品制備完成后，分別在0、15、30、60、90、120 min，測(cè)定吸光度，每次測(cè)定后，容量瓶用封口膠封口并保存于冰箱中。結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，樣品溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定。若樣品處理好后無法及時(shí)上機(jī)測(cè)定，容量瓶應(yīng)用封口膠封口并保存于冰箱，且應(yīng)在120min內(nèi)完成上機(jī)測(cè)定。

2.16重現(xiàn)性試驗(yàn)

由兩名實(shí)驗(yàn)人員按“3檢測(cè)方法”所述方法對(duì)樣品B（2）進(jìn)行處理，每人平行操作3份，測(cè)定吸光度，結(jié)果見表5。

由表5可以看出，不同人員采用該方法對(duì)同一樣品進(jìn)行處理，各自的平均吸光度分別為0.329及0.332，吸光度值相差0.003，差異極小，平均RSD為1.27%，由此說明，該方法重現(xiàn)性較好。

2.17回收率試驗(yàn)

吸取2 mL已知含量的B（2）樣品（總黃酮含量為13.33mg/100mL，由多次測(cè)量的平均值計(jì)算所得）6份，按樣品含量的100%加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為），按“3檢測(cè)方法”所述方法處理，于360nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果如表6所示。

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，方法可靠。

討論：

1.聚酰胺的粒徑篩選，粒徑對(duì)總黃酮含量測(cè)定結(jié)果有顯著性影響，粒徑為80～100目的分離富集效果最佳;

2.試劑篩選對(duì)樣品除雜與不除雜，對(duì)總黃酮的含量測(cè)定無顯著性差異，考慮對(duì)操作者的環(huán)保及勞動(dòng)保護(hù)，因此，供試液制備不經(jīng)除雜劑洗脫。

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