張林華，吳嘉瑞，姜 迪，孟子琦，張景媛

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029； 2.北京市衛(wèi)生局臨床藥學研究所，北京 100035)

白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，性微寒，味苦、酸；入肝、脾經(jīng)；具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛和平抑肝陽等功效；臨床用于治療頭疼、眩暈、肋痛腹痛、四肢攣痛、月經(jīng)不調(diào)及自汗盜汗等癥。藥理研究結果表明，白芍具有抗炎、抗免疫和鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等藥理作用[1]。桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，味辛、甘，性溫；入心、肺、膀胱經(jīng)；具有散寒解表、溫通經(jīng)脈和通陽化氣之功效；臨床多用于風寒感冒、脘腹冷痛、血寒經(jīng)閉、關節(jié)痹痛、痰飲、水腫及心悸等病癥。藥理研究結果表明，桂枝具有緩和腸胃刺激、強心、改善微循環(huán)、抗炎和抗血小板聚集等多種藥理活性[2]。中藥是多組分、多靶點及其組分間協(xié)同作用的復雜體系，因其成分復雜，系統(tǒng)龐大，使其深入研究呈現(xiàn)出巨大困難。網(wǎng)絡藥理學為復雜中藥系統(tǒng)的研究提供了新的思路，融合了系統(tǒng)生物學和多向藥理學的思想，從整體觀念出發(fā)，探索藥物與疾病的關聯(lián)性，強調(diào)從藥物、靶點與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，闡釋中藥的多成分-多靶點的作用關系，已被廣泛應用于中藥潛在活性成分和作用靶點的預測以及中藥作用機制的探索[3-5]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，探討“白芍-桂枝”藥對治療類風濕關節(jié)炎的作用機制。

1 資料與方法

1.1 化學成分的構建

依托中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)，檢索與白芍、桂枝相關的所有化學成分，其中與白芍有關的化學成分85個，與桂枝相關的化學成分220個，兩者含有的相同成分7個，故“白芍-桂枝”中含有的相關化學成分共298個。

1.2 口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)預測

基于樣品量、數(shù)據(jù)的復雜性以及綜合文獻的考慮，，選擇OB≥30%、DL≥0.18作為化合物分子的篩選條件，通過條件篩選，298個化合物分子中有17個符合條件，將其作為候選化合物。

1.3 “化合物-靶點蛋白”網(wǎng)絡的構建

通過TCMSP平臺尋找與17個化合物相關的潛在靶點，將候選化合物與其潛在的靶點蛋白生成一個體現(xiàn)藥物靶點相互作用的網(wǎng)絡圖。使用Cytoscape 3.7.0軟件構建“化合物-靶點”網(wǎng)絡。Cytoscape 3.7.0是一款可以圖形化顯示網(wǎng)絡并可進行分析和編輯的軟件，支持多種網(wǎng)絡描述格式，也可以用Microsoft Excel等文件作為輸入源，或者利用軟件本身的編輯器模塊直接構建網(wǎng)絡。

1.4 類風濕關節(jié)炎相關靶標蛋白質的收集

治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(http://bidd.nus.edu.sg/BIDDDatabases/TTD/TTD.asp)是一個提供已知或正在探索的可用作治療的蛋白質靶點和核苷酸靶點的信息，以及與之相對應的靶疾病、靶通路和相應藥物/配體信息的數(shù)據(jù)庫。以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞進行搜索，收集與類風濕關節(jié)炎相關的蛋白。

1.5 “化合物-疾病靶點”網(wǎng)絡的構建

分析“白芍-桂枝”藥對對應的化合物靶點以及疾病對應的靶點，通過Cytoscape 3.7.0軟件繪制“化合物-疾病靶點”網(wǎng)絡。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

為了說明“白芍-桂枝”藥物治療類風濕關節(jié)炎的潛在作用靶點在基因功能和信號通路中的作用，采用David v6.8數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對“白芍-桂枝”藥對活性成分潛在靶點網(wǎng)絡中的蛋白進行GO功能富集分析和基于KEGG的生物通路富集分析，繪制氣泡圖，并利用Cytoscape 3.7.0對KEGG通路富集分析中的信號通路構建“藥對-化合物靶點-通路”網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 候選化合物基本信息

“白芍-桂枝”藥對中含有的17個候選化合物有良好的OB和DL，見表1。

表1 候選化合物基本信息Tab 1 Basic information of candidate compounds

2.2 化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡分析

將17個化合物及其潛在的靶標相連，構建化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡圖，見圖1?；衔?靶點相互作用網(wǎng)絡包含105個節(jié)點(11個化合物和94個潛在靶點)和142條邊，因有6個化合物在該數(shù)據(jù)庫中并未找到相關的靶點，故構建的化合物-靶點網(wǎng)絡中只顯示11個化合物。在網(wǎng)絡圖中，長方形節(jié)點代表化合物，圓形節(jié)點代表靶點，1個節(jié)點的度表示網(wǎng)絡中和節(jié)點相連的路線條數(shù)。如每個長方形的度表示候選化合物分子所擁有的靶點數(shù)目；而每個圓形的度則代表相應靶點所相關的候選化合物分子的數(shù)目。由圖可見，分子M422(kaempferol，山奈酚)有最多的潛在靶標(62個)，其次為M358(beta-sitosterol，β-谷甾醇)(37個潛在靶標)，然后是M492[(+)-catechin，兒茶素]和M4576(taxifolin，紫杉葉素)(均有11個潛在靶標)。上述數(shù)據(jù)表示，度值高的藥物分子有可能在“白芍-桂枝”藥對的藥理功能中發(fā)揮著較為重要的作用。兒茶素可以通過抑制關節(jié)炎大鼠滑膜細胞亢進的代謝、增殖和分泌功能來發(fā)揮抗炎作用[6]。山奈酚能夠明顯改善骨質疏松大鼠骨小梁的形態(tài)結構[7]。

圖1 “白芍-桂枝”化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡圖Fig 1 Network of molecular-target interaction of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus”

2.3 類風濕關節(jié)炎相關的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡

TTD中檢索到88個與類風濕關節(jié)炎相關的一級蛋白，見表2。

2.4 與類風濕關節(jié)炎相關的“白芍-桂枝”藥對化合物-潛在靶點網(wǎng)絡

將“白芍-桂枝”藥對“活性成分-預測靶點”網(wǎng)絡和與類風濕關節(jié)炎相關的PPI網(wǎng)絡合并，從網(wǎng)絡中刪除沒有交集的蛋白，直觀得到“白芍-桂枝”藥對中活性成分治療類風濕關節(jié)炎的靶點。節(jié)點間的連接原則為“白芍-桂枝”藥對中活性成分作用靶點與類風濕關節(jié)炎靶點相同時，將活性成分與類風濕關節(jié)炎聯(lián)系起來，相同的靶點則為“白芍-桂枝”藥對中活性成分治療類風濕關節(jié)炎的潛在靶點。在STRING 10.5數(shù)據(jù)庫中檢索，選取分值>0.4的高置信度蛋白質，并得到PPI網(wǎng)絡，見圖2。將STRING 10.5數(shù)據(jù)庫中得到的數(shù)據(jù)以及相交靶點對應化合物導入Cytoscape 3.7.0軟件中，構建與類風濕關節(jié)炎相關的“白芍-桂枝”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡，見圖3；圖中，長方形表示化合物，圓形表示疾病靶點。圖3的網(wǎng)絡中得到12個節(jié)點(5個化合物，7個靶點基因)，22條相互作用關系。通過STRING 10.5數(shù)據(jù)庫的進一步擴展，將數(shù)據(jù)再次導入Cytoscape 3.7.0軟件中進行化合物及疾病靶點基因網(wǎng)絡的構建，見圖4；圖中，長方形表示化合物，橢圓形表示一級蛋白，菱形表示二級蛋白，節(jié)點大小與節(jié)點的度值成正比。圖4的網(wǎng)絡中包含32個節(jié)點，190條相互作用關系(連線)。將度值≥15的蛋白質節(jié)點列出，見表3。結果顯示，度值最高的為“IL6”“JUN”其次為“TNF”“MAPK8”“FOS”和“MAPK1”。說明上述蛋白質在網(wǎng)絡中發(fā)揮了關鍵的作用，成為聯(lián)通網(wǎng)絡的橋梁。白細胞介素是由多種細胞產(chǎn)生并作用于多種細胞的一類細胞因子，在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖和分化以及炎癥反應中發(fā)揮著重要作用。IL-6是由淋巴細胞或非淋巴細胞產(chǎn)生的一種多功能細胞因子，在機體免疫應答、急相反應和造血調(diào)控中發(fā)揮重要作用。IL-6通過刺激骨吸收的調(diào)節(jié)作用，進一步刺激破骨細胞的前體細胞，激發(fā)破骨細胞活性，促進骨質吸收，導致骨質破壞[8]。TNF通過旁分泌作用，在組織損傷局部可產(chǎn)生高濃度，引起成骨細胞凋亡，進而影響骨代謝、骨平衡。TNF參與機體的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應[9]。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用David平臺的GO和KEGG通路富集分析功能，對與類風濕關節(jié)炎相關的“白芍-桂枝”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡中涉及的32個蛋白在信號通路中的作用進行研究。在GO富集分析中，根據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)確定了32個GO條目(FDR<0.1)，并做相應的氣泡圖，見表4、圖5。其中，信號通路包括TNF信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、NOD樣受體通路和Toll樣受體通路；疾病通路有乙型肝炎、南美錐蟲病(美洲錐蟲病)、弓形蟲病、沙門菌感染、結直腸癌、類風濕關節(jié)炎和破骨細胞分化等通路。由表4可見，生物過程相關條目22個，涉及轉錄因子的活性調(diào)節(jié)、IL-6介導的信號通路、破骨細胞分化的正調(diào)控、炎癥反應和轉錄因子活性調(diào)節(jié)等方面；分子功能相關條目9個，涉及轉錄因子活性、轉錄因子結合等方面；細胞成分相關條目1個，即IL-6受體復合物。通過KEGG分析，得到81條信號通路，根據(jù)FDR<0.05篩選出35條通路，將這35條通路數(shù)據(jù)列出并做相應的氣泡圖，見表5、圖6。將“白芍-桂枝”藥對、化合物、靶點及KEGG通路導入Cytoscape 3.7.0的數(shù)據(jù)庫中，構建“藥對-化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡，見圖7。

表2 與類風濕關節(jié)炎相關的88個蛋白Tab 2 88 proteins associated with rheumatoid arthritis

表2(續(xù))

序號基因名稱蛋白質名稱65N/A“ProteinTat”(蛋白質Tat)66PNP“Purinenucleosidephosphorylase”(嘌呤核苷磷酸化酶)67ROCK2“Rho-associatedproteinkinase2”(Rho相關蛋白激酶2)68S1PR1“Sphingosine1-phosphatereceptor1”(鞘氨醇1-磷酸受體1)69SGPL1“Sphingosine-1-phosphatelyase1”(鞘氨醇1-磷酸裂合酶1)70ESRRA“SteroidhormonereceptorERR1”(類固醇激素受體ERR1)71MMP3“Stromelysin-1”(基質分解素1)72CD4“T-cellsurfaceglycoproteinCD4”(T細胞表面糖蛋白CD4)73CD80“T-lymphocyteactivationantigenCD80”(T淋巴細胞活化抗原CD80)74CD86“T-lymphocyteactivationantigenCD86”(T淋巴細胞活化抗原CD86)75JUN“TranscriptionfactorAP-1”(轉錄因子AP-1)76TSPO“Translocatorprotein”(轉運蛋白)77TNF“Tumornecrosisfactor”(腫瘤壞死因子)78TNFSF11“Tumornecrosisfactorligandsuperfamilymember11”(腫瘤壞死因子配體超家族成員11)79TNFSF12“Tumornecrosisfactorligandsuperfamilymember12”(腫瘤壞死因子配體超家族成員12)80TNFRSF1A“Tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember1A”(腫瘤壞死因子受體超家族成員1A)81LTBR“Tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember3”(腫瘤壞死因子受體超家族成員3)82CD40“Tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember5”(腫瘤壞死因子受體超家族成員5)83FAS“Tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember6”(腫瘤壞死因子受體超家族成員6)84TYR“Tyrosinase”(酪氨酸酶)85BTK“Tyrosine-proteinkinaseBTK”(酪氨酸蛋白激酶BTK)86JAK1“Tyrosine-proteinkinaseJAK1”(酪氨酸蛋白激酶JAK1)87JAK3“Tyrosine-proteinkinaseJAK3”(酪氨酸蛋白激酶JAK3)88SYK“Tyrosine-proteinkinaseSYK”(酪氨酸蛋白激酶SYK)

圖2 相交靶點的PPI網(wǎng)絡Fig 2 PPI network of intersecting targets

圖3 “白芍-桂枝”藥對“化合物-疾病靶點”網(wǎng)絡圖Fig 3 Network of compound-disease target of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus”

3 討論

類風濕關節(jié)炎是一種嚴重的慢性自身免疫性炎癥性疾病，多發(fā)于手、足小關節(jié)，嚴重者導致關節(jié)畸形，甚至功能喪失，具有對稱性。該病在全球都有分布，發(fā)病率約為1%。中醫(yī)藥具有良好的臨床療效以及毒副作用小等特點，常用于臨床治療中。白芍具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保肝等藥理作用；桂枝具有抗菌、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。白芍配伍桂枝具有協(xié)同作用，抗炎作用顯著提高。本研究構建“白芍-桂枝”藥對“活性成分-預測靶點”網(wǎng)絡，構建與類風濕關節(jié)炎相關的“白芍-桂枝”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡，進而系統(tǒng)分析“白芍-桂枝”藥對治療類風濕關節(jié)炎的作用機制。

圖4 擴展后的“化合物-靶點基因”網(wǎng)絡圖Fig 4 Extended compound-target gene network

序號蛋白質基因節(jié)點的度值1IL6232JUN233TNF214MAPK8215FOS206MAPK1207PTGS2198MAPK3189STAT31810CREB11711MAPK91612MMP11513FOSL11514TNFRSF1A1415ATF31416FOSB1317IL17A1318TIMP11219FOSL21120NFATC211

表4 與類風濕關節(jié)炎相關的“白芍-桂枝”藥對潛在靶點GO條目Tab 4 Potential target GO entry of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus” related to rheumatoid arthritis

圖5 GO條目的氣泡圖Fig 5 Bubble chart of GO entry

圖6 KEGG通路的氣泡圖Fig 6 Bubble diagram of KEGG pathway

表5 與類風濕關節(jié)炎相關的“白芍-桂枝”藥對潛在靶點KEGG富集通路Tab 5 Potential target enrichment analysis of KEGG of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus” related to rheumatoid arthritis

圖7 “白芍-桂枝”藥對“藥物-化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡圖Fig 7 Network of drug-compound-target-pathway of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus”

與類風濕關節(jié)炎相關的“白芍-桂枝”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡中包含27個靶點，分別為“IL6”“JUN”“TNF”“MAPK8”“FOS”“MAPK1”“PTGS2”“MAPK3”“STAT3”“CREB1”“MAPK9”“MMP1”“FOSL1”“TNFRSF1A”“ATF3”“FOSB”“IL17 A”“TIMP1”“FOSL2”“NFATC2”“IL6R”“TNFRSF1B”“MAPK10”“ALOX5”“IL6ST”“AKR1B1”和“ALOX5AP”。其中，度值>20的靶點為“IL6”“JUN”“TNF”和“MAPK8”，推測“白芍-桂枝”藥對有效成分可能通過上述靶點發(fā)揮作用。白細胞介素對類風濕關節(jié)炎骨破壞有調(diào)控作用。關節(jié)軟骨及骨破壞是類風濕關節(jié)炎的主要病理變化，是患者致殘的主要原因[8]。從KEGG得到的通路圖列表中可見，第1個通路，即“Osteoclast differentiation”(hsa04380)，為破骨細胞分化。破骨細胞在類風濕關節(jié)炎骨破壞的病理過程中起著關鍵作用，其調(diào)控依賴于破骨細胞形成、分化及活化的過程。巨噬細胞、滑膜成纖維細胞等是破骨細胞形成的主要來源，促炎因子在這個過程中起著重要作用。破骨細胞是骨侵蝕發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，是體內(nèi)唯一具有溶解骨組織能力的細胞。IL-6的過度表達會促進破骨細胞形成和分化，促進骨的重吸收[10]。與該通路有關的基因有14個，其中包括“TNF”“MAPK1”“MAPK3”“MAPK8”和“MAPK9”等。通路“MAPK signaling pathway”(hsa04010)，即MAPK信號通路。MAPK是真核細胞信號傳遞的重要途徑之一，在調(diào)節(jié)控制細胞結構和功能活性中發(fā)揮著關鍵作用。MAPK信號通路在類風濕關節(jié)炎的發(fā)病機制中發(fā)揮著關鍵性作用，其可被細胞外信號或刺激激活，將細胞外信號逐級放大傳至細胞內(nèi)，調(diào)節(jié)轉錄因子的活性，調(diào)控相應基因的表達，進而引起細胞反應[11]。與該信號通路相關的靶點基因有“TNF”“MAPK1”“MAPK3”“MAPK8”“MAPK9”和“MAPK10”等。類風濕關節(jié)炎特征性病理改變包括關節(jié)滑膜組織炎癥細胞浸潤、骨關節(jié)及軟骨的破壞與侵蝕，涉及的細胞包括滑膜細胞、淋巴細胞、破骨細胞、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞等[12]。上述2條通路中都涉及到了TNF這個靶點。TNF是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在關節(jié)滑膜炎性病變及軟骨基質降解中起著重要作用。TNF-α是類風濕關節(jié)炎發(fā)病的重要因子之一，其源于巨噬細胞，可促進血管內(nèi)皮細胞吸附白細胞，造成炎癥局部白細胞聚集，尤其是滑液中TNF-α水平異常升高可能對類風濕關節(jié)炎有一定的作用。TNF-α可影響滑膜中的各種細胞，如巨噬細胞、滑膜細胞、軟骨細胞和破骨細胞等，誘導局部炎癥和血管翳形成，導致軟骨侵蝕和骨破壞[13-14]。同時，還涉及了通路“Rheumatoid arthritis”(hsa05323)，即類風濕關節(jié)炎通路，相關的基因靶點分別為“FOS”“IL17 A”“IL6”“TNF”“JUN”和“MMP1”。這與得到的相交靶點結果“AKR1B1”“ALOX5”“IL6”“JUN”“MMP1”“TNF”和“PTGS2”相比較，很容易得出“IL6”“TNF”“JUN”和“MMP1”4個靶點基因的相關性更高，且上述靶點很有可能就是針對類風濕關節(jié)炎疾病的。因此，類風濕關節(jié)炎通路尤為重要。