鄧志華 黃贊松 曹 聰 胡高裕 黃桂柳 覃小珊

(廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，百色市 533000，電子郵箱：369839795@qq.com)

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是全球三大惡性腫瘤之一。全世界范圍內(nèi)，在男性人群中肝癌死亡率位居所有惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌[1]。在我國，肝癌死亡率在所有腫瘤中排名第二[2]。目前手術(shù)仍為肝癌最主要的治療方式，但發(fā)現(xiàn)晚、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移等因素導(dǎo)致大量患者失去手術(shù)治療的機(jī)會，因此，尋找具有抗肝癌作用的藥物具有重大意義。

研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)作為一種生存信號，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和生長[3],其可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯而影響腫瘤細(xì)胞增殖[4]。近年研究表明，MAPK信號通路與肝癌細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)[5-6]。細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是細(xì)胞周期的啟動因子，與肝癌細(xì)胞增殖有關(guān)[7-8]。在肝癌中,MAPK信號通路可能作用于Cyclin D1而影響肝癌細(xì)胞周期與增殖[9]。苦參素是從豆科植物苦參中提取的生物堿，近年來大量研究表明其可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α等多種通路發(fā)揮抗腫瘤作用，但具體機(jī)制尚未明確[10-12]。本課題組的前期研究表明，苦參素具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用[13-14]，其作用機(jī)制尚未完全明確，是否與MAPK信號通路及Cyclin D1相關(guān)也尚未明確。故本研究探討苦參素對肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖的抑制作用及對MAPK1及Cyclin D1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 人肝癌細(xì)胞株Bel-7404購自中科院上海細(xì)胞庫?？鄥⑺刈⑸湟嘿徸院碧焖幩帢I(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字：H20051156)。胎牛血清購自Gibco公司(批號：1982158C)，磷酸緩沖鹽溶液(1×)、胰酶、青鏈霉素混合液(100×)、二甲基亞砜等購自北京索萊寶科技有限公司(批號：P1002、T1300、P1400、D2650)，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司(批號：8119072)，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自Amresco公司(批號：0793)，TRIzol試劑購自Invitrogen公司(批號：15596026)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司(批號：K1622)，實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自Ambion公司(批號：AM1005)，細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管等購自Corning公司。Cyclin D1、MAPK1引物由Invitrogen公司設(shè)計并合成。PCR儀購自Bio-Rad公司(型號：iQTM5 Optical Module)。自動酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher Scientific公司(型號：Multiskan MK3)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 分為苦參素組、陰性對照組(Bel-7404細(xì)胞+不含藥物的完全培養(yǎng)基)及空白對照組(不含細(xì)胞，只有完全培養(yǎng)基)。其中苦參素濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL。經(jīng)陰性對照組與空白對照組校正后得到對照組。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取處于對數(shù)生長期Bel-7404細(xì)胞，常規(guī)消化并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，再接種至96孔板中，接種密度為5×104個/mL，置于飽和濕度、37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁(約4～5 h)后，取出96孔板，棄舊培養(yǎng)基，苦參素組加入含相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)液，100 μL/孔，陰性對照組及空白對照組加入等量不含藥物的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔。(3)MTT試驗(yàn)：繼續(xù)培養(yǎng)48 h或72 h后，取出96孔板，于每個孔中加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)于飽和濕度、37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后取出細(xì)胞，吸掉上清液，加入二甲基亞砜150 μL/孔，置于37℃恒溫箱中振蕩10 min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解后于自動酶標(biāo)儀上檢測各孔490 nm處吸光度值(A值)并計算抑制率。對照組A值=陰性對照組A值-空白對照組A值，實(shí)驗(yàn)組A值=藥物組A值-空白對照組A值，抑制率=(對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制濃度效應(yīng)曲線，求回歸方程，計算出苦參素對Bel-7404細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR法檢測Bel-7404細(xì)胞中Cyclin D1及MAPK1的表達(dá) (1)細(xì)胞制備：根據(jù)MTT結(jié)果，選擇作用72 h的IC50值作為干預(yù)條件，接種細(xì)胞1瓶，按消化傳代方法取等量細(xì)胞接種于2個新的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，1瓶作為苦參素組，加入含IC50濃度(經(jīng)計算為3.8 mg/mL)苦參素的培養(yǎng)液3 mL，另一瓶作為陰性對照組，加入等量培養(yǎng)液，作用72 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)提取細(xì)胞總RNA：取出上述制備好的細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗細(xì)胞2次，1～2 min/次，加入適量TRIzol試劑裂解細(xì)胞，將裂解液移至新EP管中，加入適量氯仿，振蕩搖勻、靜置2～3 min后于11 327 r/min、4℃下離心15 min，吸取最上層含RNA的液體，再加入異丙醇沉淀，11 327 r/min、4℃下離心10 min，棄上清液后加入75%乙醇，振蕩15 s，8 937 r/min、4℃下離心5 min后取沉淀，加入焦碳酸二乙酯水溶解RNA，混勻。于紫外分光光度計上測定RNA濃度。(3)反轉(zhuǎn)錄：取出上述提取的RNA及反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說明書制備反轉(zhuǎn)錄混合液，具體操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行，合成的cDNA于-20℃中保存?zhèn)溆谩?4)實(shí)時熒光定量PCR：參照試劑盒說明書，配制反應(yīng)體系，各樣品、各基因分管同機(jī)進(jìn)行反應(yīng)，引物序列如表1，每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 10 min，退火、延伸95℃ 15 s，55℃ 1 min，共45個循環(huán)，溶解曲線分析55℃ 1 min，55～95℃ 30 s。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 苦參素作用Bel-7404細(xì)胞48 h及72 h后的抑制率 苦參素分別作用48 h及72 h后，各濃度苦參素組的抑制率均高于對照組，且抑制率隨苦參素濃度的升高而升高(均P<0.05)。2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL苦參素組中，72 h抑制率均高于48 h(均P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度苦參素作用Bel-7404細(xì)胞48 h及72 h后的抑制率比較(x±s，%)

注：與對照組比較，*P<0.05；與0.5 mg/mL苦參素組比較，aP<0.05；與1 mg/mL苦參素組比較，bP<0.05；與2 mg/mL苦參素組比較，cP<0.05；與4 mg/mL苦參素組比較，dP<0.05。

2.2 苦參素組Cyclin D1及MAPK1 mRNA表達(dá) 苦參素組Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而MAPK1 mRNA相對表達(dá)量高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組細(xì)胞Cyclin D1及MAPK1 mRNA相對表達(dá)量比較(x±s)

3 討 論

近年來，大量研究表明，苦參素可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶、ERK、缺氧誘導(dǎo)因子-1α等多種通路發(fā)揮抗腫瘤作用[10-12]。在肝癌中，苦參素可抑制肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞的增殖[15]，也可通過影響MAPK通路中的磷脂酰肌醇3-激酶及P38通路而抑制大鼠肝BRL-3A細(xì)胞的凋亡[16]；在食管癌中，苦參素可通過下調(diào)ERK1/2、Cyclin D1的表達(dá)，而誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞Eca109發(fā)生凋亡[12]；此外，苦參堿可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯，其機(jī)制可能與其下調(diào)Cyclin D1蛋白表達(dá)有關(guān)[17]。以上研究結(jié)果提示苦參素抗腫瘤作用機(jī)制與MAPK信號通路有關(guān)，且可能通過Cyclin D1起抗腫瘤作用。

MAPK信號通路是參與細(xì)胞生長、增殖、分化等過程的重要通路，幾乎涉及生命的各個過程，該信號通路主要包括ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、P38 MAPK及ERK5等信號通路。MAPK1又稱為ERK2，是MAPK/ERK信號通路的一個成員，也是MAPK信號通路的一個關(guān)鍵激酶，且在細(xì)胞增殖中起重要作用[18]。受到外界信號的刺激后，MAPK1發(fā)生磷酸化，作用于下游的細(xì)胞周期蛋白如Cyclin D1蛋白，最終促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期[19]。

研究表明，苦參素可阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖[15-17,20-21]。本研究結(jié)果顯示，苦參素分別作用48 h及72 h后，各濃度苦參素組的抑制率均高于對照組，且抑制率隨苦參素濃度的增加而升高(均P<0.05)，且2～8 mg/mL的苦參素組中，72 h抑制率均高于48 h(P<0.05)。這提示苦參素可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且是一定的濃度及時間依賴性。

此外，苦參素組MAPK1 mRNA相對表達(dá)量高于對照組(P>0.05)，而Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示苦參素作用后Cyclin D1基因表達(dá)無變化，但可上調(diào)MAPK1基因表達(dá)。這與既往研究[12,15-17,22]有相似之處也有矛盾的地方，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)苦參素可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且可能與MAPK信號通路有關(guān)，這與本研究結(jié)果相似；但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)苦參素可通過MAPK/Cyclin D1通路影響腫瘤細(xì)胞增殖，或發(fā)現(xiàn)苦參素可作用于Cyclin D1影響細(xì)胞周期，但不是通過ERK1/2信號通路起作用，這是與本研究結(jié)果不一致。究其原因，考慮可能與腫瘤細(xì)胞類別、病理類型、細(xì)胞狀態(tài)等多種因素不同相關(guān)。

綜上所述，苦參素可抑制肝癌細(xì)胞增殖，這可能與MAPK信號通路有關(guān)。但本研究只探討了MAPK1基因表達(dá)的變化，未能分析其蛋白表達(dá)是否發(fā)生改變；且MAPK通路包括多條信號通路，苦參素對各通路表達(dá)的影響也尚不明確，將來可進(jìn)一步探討苦參素對MAPK各信號通路的影響。