曲 航 黃 宇 廖 浩 裴文迪 黃 琴

(1 南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東省廣州市 510282，電子郵箱：15265420979@163.com；2 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東省廣州市 510515)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種全身性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜,可以累及多個(gè)系統(tǒng)，其中神經(jīng)精神性狼瘡(neuropsychiatric systemic lupus erythematosus,NPSLE)是SLE的嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology,ACR)將NPSLE分為19種，包括頭痛、癲癇、腦血管病、無菌性腦膜炎、精神障礙、認(rèn)知障礙等。近年多項(xiàng)研究表明，NPSLE與自身抗體之間存在關(guān)聯(lián)，如抗磷脂抗體、抗核糖體P蛋白抗體(anti-ribosomal P protein antibody，ARPPA)和N-甲基-D-天[門]冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)抗體等[2-4]。

NMDAR是一種配體門控離子通道，由兩個(gè)N-甲基-D-天冬氨酸受體亞單位(N-methyl-D-aspartate receptor subunit，NR)1亞基和兩個(gè)NR2亞基組成四聚體，在認(rèn)知、記憶功能和神經(jīng)元的存活中起重要作用。多種顱腦病變與NMDAR的過度激活有關(guān)，如中風(fēng)、慢性神經(jīng)退行性疾病、癲癇、精神分裂癥等[5-8]。目前越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞上抗N-甲基-D-天[門]冬氨酸受體亞單位2A抗體(抗NR2A抗體)與NPSLE存在相關(guān)性，但具體與哪類神經(jīng)精神癥狀相關(guān)，結(jié)論尚未明確，且這些研究主要集中在歐美人群，國內(nèi)研究甚少[9-13]，因此分析抗NR2A抗體在中國狼瘡患者中的表達(dá)情況具有重要意義。本研究探討抗NR2A抗體在NPSLE中的表達(dá)水平及其與疾病活動度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月至2015年1月就診于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院的73例成年活動期SLE患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1997年ACR制訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)[14]，患者年滿18周歲并有完整的臨床資料。排除晚期腎功能衰竭、重度感染、既往有精神疾病史及糖皮質(zhì)激素性躁狂癥等患者。采用SLE疾病活動指數(shù)2000(SLE disease activity index-2000,SLEDAI-2000)評估疾病的活動性，SLEDAI-2000評分≥4分為處于活動期[15]。其中女64例，男9例，年齡18～62(28.03±9.82)歲，SLEDAI-2000評分5～30(11.00±3.90)分，均處于疾病活動期。根據(jù)1999年ACR提出的NPSLE分類標(biāo)準(zhǔn)[15]，將患者分為NPSLE組36例和非NPSLE組37例。NPSLE組中，女性32例，男性4例，發(fā)病年齡(28.4±11.4)歲；非NPSLE組中，女性32例，男性5例，發(fā)病年齡(30.2±13.2)歲。兩組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 血清學(xué)指標(biāo)的檢測 收集患者清晨空腹肘靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min后，以1 500 r/min離心10 min分離血清，將含微粒的血清經(jīng)低速離心凈化(1 500 r/min，10 min)。血清標(biāo)本分裝在干燥的凍存管中，于-80℃凍存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法，以肽抗原DWEYSVWLSN(DWEYS肽，購自北京華大基因有限公司)作為抗原，檢測抗NR2A抗體的滴度[16]。檢測步驟如下：96孔板每孔包被1 μg肽抗原，加入100 μL 10×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)4℃過夜；每孔加入200 μL 10%胎牛血清室溫下封閉1 h；用1×PBS液進(jìn)行洗滌(洗液加滿每孔，靜置5 min，棄掉洗液，重新加滿，重復(fù)洗滌3～6次后拍干)；在肽抗原處理過的96孔板中加入患者血清(1 ∶100稀釋)，室溫下孵育2 h；同樣方法用1×PBS液洗滌3～6次，然后每孔加入200 μL過氧化物酶偶聯(lián)的IgG抗體(1 ∶1 000稀釋)37℃孵育30 min，再次洗滌3～6次，隨后加入底物溶液A(過氧化氫還原溶液)和底物溶液B(四甲基聯(lián)苯胺顯色液)各50 μL/孔，37℃避光孵育15 min，最后加入終止液(H2SO4)50 μL/孔，孵育5 min終止反應(yīng)；使用全自動酶標(biāo)儀(BioTek公司，型號：ELX-800)讀取450 nm處吸光值。以吸光度值作為抗NR2A抗體相對定量水平，組內(nèi)和組間差異(變異系數(shù))分別為5%和15%。

此外，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定抗核抗體、抗雙鏈脫氧核糖核酸(double-stranded DNA，dsDNA)抗體；采用免疫印跡法測定抗干燥綜合征抗原A(Sj?gren′s syndrome antigen A，SSA)抗體、抗干燥綜合征抗原B(Sj?gren′s syndrome antigen B，SSB)抗體、ARPPA。采用免疫比濁法測定補(bǔ)體C3、C4水平。相關(guān)試劑盒均購自歐蒙公司，實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3 評估NPSLE患者神經(jīng)精神情況 根據(jù)ACR對NPSLE神經(jīng)精神癥狀的標(biāo)準(zhǔn)化定義[15]，結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)表現(xiàn)及神經(jīng)精神評估量表[17]，可將NPSLE患者神經(jīng)精神癥狀分為兩個(gè)亞群——中樞神經(jīng)系統(tǒng)亞群和周圍神經(jīng)系統(tǒng)亞群。中樞神經(jīng)系統(tǒng)亞群包括無菌性腦膜炎、腦血管病、脫髓鞘綜合征、頭痛、運(yùn)動障礙、脊髓病、癲癇發(fā)作、急性精神錯(cuò)亂、焦慮、認(rèn)知功能障礙、情緒失調(diào)和精神障礙；周圍神經(jīng)系統(tǒng)亞群包括格林-巴利綜合征、自主神經(jīng)病變、單神經(jīng)病、重癥肌無力、顱神經(jīng)病變、神經(jīng)叢病變、多發(fā)性神經(jīng)病變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者SLEDAI-2000評分自身抗體及補(bǔ)體水平的比較 NPSLE組的SLEDAI-2000評分和血清抗ds-DNA抗體、抗NR2A抗體水平均高于非NPSLE組(P<0.05)。兩組間抗核抗體水平、ARPPA陽性率、抗SSA抗體陽性率、抗SSB抗體陽性率、C3及C4水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組SLEDAI-2000評分、自身抗體及補(bǔ)體水平比較

2.2 36例NPSLE患者神經(jīng)精神情況 36例NPSLE患者發(fā)病以來總共發(fā)作69次神經(jīng)精神癥狀，包含了19種NPSLE癥狀中的10種，其中出現(xiàn)樞神經(jīng)系統(tǒng)亞群者占94.4%(34/36)，出現(xiàn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)亞群者占5.6%(2/36)。主要的臨床表現(xiàn)包括：癲癇發(fā)作占47.2%(17/36)，頭痛占33.3%(12/36)，認(rèn)知功能障礙占27.8%(10/36)，精神病(精神分裂癥)占22.2%(8/36)，腦血管疾病占16.7%(6/36)。10例認(rèn)知障礙NPSLE患者的抗NR2A抗體水平為(0.484±0.008)，其余26例無認(rèn)知障礙NPSLE患者的抗NR2A抗體水平為(0.485±0.011)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.261，P=0.796)。

2.3 抗NR2A抗體水平與NPSLE患者病情的相關(guān)性 NPSLE組中，抗NR2A抗體水平與SLEDAI-2000評分、抗dsDNA抗體水平呈正相關(guān)(r=0.355，P=0.034；r=0.535，P<0.001)，與C3、C4水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.432，P=0.008；r=-0.378，P=0.023)。

2.4 抗NR2A抗體與ARPPA的關(guān)系 分別將36例NPSLE患者和37例非NPSLE患者分為ARPPA陽性組及ARPPA陰性組。在NPSLE患者中，ARPPA陽性組的抗NR2A抗體水平為(0.51±0.04)，高于ARPPA陰性組的(0.44±0.02)(t=6.987，P<0.001)；在非NPSLE患者中，ARPPA陽性組的抗NR2A抗體水平為(0.42±0.02)，高于ARPPA陰性組的(0.40±0.02)(t=2.848，P=0.007)。

3 討 論

14%～75%的SLE患者可出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀，NPSLE是SLE預(yù)后不良的表現(xiàn)[18]。NPSLE臨床表現(xiàn)多樣，包括亞臨床的認(rèn)知功能異常以及危及生命的腦血管病變等。國外文獻(xiàn)報(bào)告，NPSLE常見臨床表現(xiàn)為認(rèn)知障礙(6.6%～80.0%)、情感障礙(7.4%～65.0%)、頭痛(12.2%～28.3%)、癲癇(7.0%～20.0%)、腦血管病變(5.0%～18.0%)[19]。本研究中36例NPSLE患者總共發(fā)作69次神經(jīng)精神癥狀，以癲癇發(fā)作(47.2%)、頭痛(33.3%)、認(rèn)知功能障礙(27.8%)為主。

NMDAR是谷氨酸受體家族的一個(gè)亞組，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的快速興奮性神經(jīng)傳遞，其與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸和天冬氨酸結(jié)合，可引起神經(jīng)元細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，產(chǎn)生興奮性突觸后點(diǎn)位，但NMDAR的過度興奮會導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡，影響空間記憶的鞏固和維持，進(jìn)而引起相應(yīng)的認(rèn)知功能障礙[20]。有文獻(xiàn)報(bào)告，將抗NR2谷氨酸受體結(jié)合抗體(從SLE患者血清中提取抗體并純化后得到)注射至小鼠大腦中，可以導(dǎo)致非炎癥性神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[16]。在本研究中，抗NR2A抗體在所有SLE患者中都有表達(dá)，但NPSLE組患者的抗NR2A抗體水平高于非NPSLE組患者(P<0.05)，提示抗NMDAR抗體可能參與了NPSLE的發(fā)病機(jī)制。目前，抗NMDAR抗體是否與NPSLE認(rèn)知障礙相關(guān)仍存在爭議。Hirohata等[9]發(fā)現(xiàn)，高水平的抗NMDAR抗體與NPSLE癥狀明顯相關(guān)，尤其是焦慮障礙、認(rèn)知障礙和精神病。周艷[10]發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知障礙的NPSLE患者血清抗NMDAR抗體表達(dá)水平明顯高于認(rèn)知功能正常的NPSLE患者。Lapteva等[11]發(fā)現(xiàn)，SLE患者的NMDAR抗體濃度和情緒低落有關(guān)，但和認(rèn)知障礙無關(guān)。Harrison等[12]也發(fā)現(xiàn)血清抗NMDAR抗體陽性與認(rèn)知障礙沒有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，10例認(rèn)知障礙的NPSLE患者與26例認(rèn)知功能正常的NPSLE患者血清抗NR2A抗體水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此抗NR2A抗體或與認(rèn)知障礙沒有明確的相關(guān)性。

抗NR2A抗體最初被認(rèn)為是抗DNA抗體。Degiorgio等[16]的研究顯示，部分含有抗dsDNA抗體的SLE患者血清可與NR2A和NR2B亞基產(chǎn)生交叉反應(yīng)。然而，Husebye等[13]發(fā)現(xiàn)，31%的SLE患者的血清可與抗NR2A抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，而抗NR2A抗體與抗dsDNA抗體之間并無關(guān)聯(lián)，這可能是由于該研究中NPSLE患者人數(shù)過少(僅占5.5%)。本研究結(jié)果顯示，NPSLE組中抗NR2A抗體水平與SLEDAI-2000評分、抗dsDNA抗體水平呈正相關(guān)，與C3、C4水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。這提示抗NR2A抗體水平與NPSLE病情活動相關(guān)，或可成為評估NPSLE疾病活動度的血清學(xué)指標(biāo)。

ARPPA是一種細(xì)胞質(zhì)抗體，一直被認(rèn)為是一種SLE的特異性抗體，與SLE的神經(jīng)精神損害和病情活動有很大的相關(guān)性[21]。ARPPA的靶抗原為胞漿核糖體蛋白，其共同抗原表位包含3個(gè)高度保守的羧基末端殘基，即P0、P1和P2。ARPPA通過一種高質(zhì)量的質(zhì)膜蛋白——神經(jīng)表面P抗原(neuronal surface P antigen，NSPA)，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞膜上的暴露。這種質(zhì)膜蛋白專一地表達(dá)在神經(jīng)元的特定區(qū)域，包括與認(rèn)知、記憶及情感有關(guān)的區(qū)域[3]。近年研究表明，ARPPA與NPSLE的發(fā)病過程有關(guān)[22-23]。Segovia-Miranda等[24]發(fā)現(xiàn)NSPA參與谷氨酸能突觸傳遞的過程和海馬記憶的可塑性，并介導(dǎo)ARPPA在這些過程中的損害效應(yīng)，且當(dāng)ARPPA進(jìn)入共表達(dá)NSPA和NMDA受體的腦區(qū)域時(shí)，可能出現(xiàn)認(rèn)知障礙以及其他彌漫性NPSLE表現(xiàn)。Bravo-Zehnder等[25]發(fā)現(xiàn)ARPPA與海馬神經(jīng)元細(xì)胞表面的NSPA結(jié)合，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡或功能障礙。本研究結(jié)果顯示，ARPPA陽性率在NPSLE組和非NPSLE組之間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但有趣的是，在ARPPA陽性的NPSLE患者中抗NR2A抗體水平高于ARPPA陰性的患者(P<0.05)，說明這兩種抗體可能存在相關(guān)性，均在NPSLE發(fā)病過程中起重要作用。

綜上所述，NPSLE患者的抗NR2A抗體水平高于非NPSLE患者，且與疾病活動度有關(guān)，但與認(rèn)知障礙并無明確的相關(guān)性。此外，在ARPPA陽性的NPSLE患者中抗NR2A抗體表達(dá)明顯升高。因此，抗NR2A抗體可能在NPSLE的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，但是其具體的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。