韓 瑨，吳正鈞，劉振民，趙 勇

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436

糖尿病(diabetes mellitus)是一類由胰島素分泌不足或外周組織對胰島素不敏感引發(fā)的，以高血糖為特征性指標(biāo)的慢性代謝紊亂疾病，其患者長期處于高血糖、高尿糖狀態(tài)，若不及時介入控制血糖水平，可導(dǎo)致各種組織、臟器(如眼、腎等)功能障礙甚至衰竭，嚴(yán)重時可致殘甚至危及患者生命，因此，糖尿病又被稱為“萬病之源”。

Ⅱ型糖尿病，又稱為非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus,NIDDM)，是臨床上較多見的糖尿病類型(占糖尿病患者總量的85%以上)，目前治療NIDDM藥物主要有磺脲類藥物、雙胍類藥物、格列奈類藥物、噻唑烷二酮類藥物、DPP-Ⅳ抑制劑以及α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitor,α-GI)，其中α-GI以其效果溫和、副作用小等特點受到患者的青睞[1]。據(jù)統(tǒng)計，除米格列醇(Miglitol)有芽孢桿菌來源[2]外，大部分臨床上使用的α-GI，如阿卡波糖(Acarbose)[3]、伏格列波糖(Voglibose)[4]，均來自真菌類微生物(放線菌)，由此可見，有關(guān)細(xì)菌類微生物發(fā)酵產(chǎn)α-GI的開發(fā)利用仍然處于較低水平。

本文以體外模型為檢測手段，從西藏生牦牛乳中篩選得到一株可發(fā)酵脫脂乳、產(chǎn)α-GI的菌株，并將其與常規(guī)乳酸菌進行降糖活性比較，同時考察了產(chǎn)α-GI的最適條件(好氧/厭氧，30/37 ℃)與遺傳穩(wěn)定性，最后對該菌株在脫脂乳中發(fā)酵及其產(chǎn)α-GI特性進行了初步研究，旨在填補類芽孢桿菌產(chǎn)α-GI相關(guān)領(lǐng)域的相對空白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

用于篩選菌株的生牦牛乳取樣自中國西藏當(dāng)雄地區(qū)。

PaenibacillusbovisBD3526、LeuconostocmesenteroidesBD1710、LeuconostoccitreumBD1707、LactobacillushelveticusBD3809(由光明乳業(yè)股份有限公司提供)、LactobacilluscaseiATCC 334、LactobacillusrhamnosusGG ATCC 53103(購買自ATCC)、LactobacillusacidophilusNCFM、LactobacillusbulgaricusLB340、BifidobacteriumanimalisBL-04(由丹尼斯克公司提供)、StreptococcusthermophilusST-BODY-3(由科漢森公司提供)。

M17瓊脂培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基、乳糖(OXOID LTD.，英國)、脫脂乳粉(光明乳業(yè)股份有限公司，中國)、NaOH、Na2CO3、乳酸 (國藥集團化學(xué)試劑有限公司，上海)、α-葡萄糖苷酶(E.C 3.2.1.20)、pNPG(4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)(Sigma公司，美國)、MRS培養(yǎng)基(merck公司，德國)、TPY培養(yǎng)基(海博生物科技有限公司，中國)。

HVE-50型高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司；SG-402TX型超凈工作臺 美國THE BAKER COMPANY公司；AVANTI J30I型高速冷凍離心機 美國BECKMAN COULTER公司；HZQ-F160型搖床 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PHS-25型pH計 美國奧立龍公司；XW-80A型漩渦混合儀 上海青浦滬西儀器廠；Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

1.2 培養(yǎng)基的制備

分離培養(yǎng)基：取M17瓊脂培養(yǎng)基4.8 g溶解于100 mL蒸餾水中，118 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

種子培養(yǎng)基：取M17液體培養(yǎng)基3.7 g，乳糖1 g溶解于100 mL蒸餾水中，118 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：取脫脂乳粉10 g溶解于90 mL蒸餾水中，118 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離與純化

菌株的分離與純化：采用逐級稀釋法將西藏生牦牛乳稀釋至原濃度的10-4，分別取原液以及各級稀釋液0.1 mL均勻涂布于分離培養(yǎng)基上，于37 ℃厭氧培養(yǎng)2天后，觀察并用接種環(huán)挑出菌落形態(tài)(形狀、大小、顏色等)有顯著差異的菌株，再次劃線于分離培養(yǎng)基上，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)2天進行純化。

1.3.2 發(fā)酵種子的制備

從平板上挑取一環(huán)已純化菌株接種于10 mL種子培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，10 000 rpm離心15 min，取沉淀(菌餅)，以相同體積的無菌蒸餾水反復(fù)洗滌三次后重懸，即得發(fā)酵用的種子。

1.3.3α-葡萄糖苷酶抑制活性及IC50的測定

α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定：在體外測定模型PNPG法[5]的基礎(chǔ)上加以改良，簡言之： 100 μL待測樣品與50 μLα-葡萄糖苷酶(100 mU/mL)混勻，37 ℃水浴15 min，加入80 μL pNPG(2 mmol/L)混勻，再次37 ℃水浴15 min，最后加入80 μL Na2CO3(0.2 mol/L)終止反應(yīng)。該反應(yīng)體系于4 ℃、10 000 rpm離心2 min后，取200 μL上清于96孔微孔板中，利用酶標(biāo)儀測定OD405。

為了規(guī)避脫脂乳/發(fā)酵乳對反應(yīng)體系產(chǎn)生的影響，本研究采用脫脂乳上清作為陰性對照，具體制備方法如下：脫脂乳(10%，w/v)以乳酸調(diào)節(jié)至待測樣品相同pH，10 000 rpm離心2 min，取上清，1 mol/L NaOH回調(diào)pH至6.80，10 000 rpm離心2 min后取上清，即得陰性對照。取三次平行實驗的平均OD405值，代入以下公式計算α-葡萄糖苷酶抑制活性：

α-葡萄糖苷酶抑制率=

式中：陰性對照組為脫脂乳上清。

陰性空白組為PBS替代陰性對照組中的α-葡萄糖苷酶。

樣品空白組為PBS替代待測樣品組中的α-葡萄糖苷酶。

IC50的測定：將凍干粉末溶解于PBS(0.1 mol/L，pH6.8)的緩沖液中，制得濃度為80、40、20、10、5 mg/mL的待測樣品組，測定各樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，通過回歸方程擬合并計算可得抑制α-葡萄糖苷酶半數(shù)活性所需的樣品濃度，即IC50。

1.3.4 降糖菌株的初篩與復(fù)篩

初篩：分別挑取一環(huán)已純化的菌株于10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)渦旋震蕩后將菌體均勻分布于發(fā)酵體系中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h得發(fā)酵乳。將發(fā)酵乳置于沸水浴中加熱5 min滅活菌體，10 000 rpm離心15 min，取上清，以1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8，再次10 000 rpm離心15 min，取上清，檢測其α-葡萄糖苷酶抑制活性(n=3)。

復(fù)篩：將發(fā)酵種子以2%(v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h得發(fā)酵乳。參照初篩的方法由發(fā)酵乳制備獲得上清，檢測其α-葡萄糖苷酶抑制活性(n=3)。

1.3.5 不同乳酸菌制備的發(fā)酵乳對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

取不同菌株的凍干粉少量，分別劃線于對應(yīng)的培養(yǎng)基上(BD1710、BD1707、BD3809、ATCC334、NCFM、LB340、LGG/MRS培養(yǎng)基，BD3526、ST-BODY-3/M17培養(yǎng)基，BL-04/TPY培養(yǎng)基)，37 ℃厭氧培養(yǎng)2天形成菌落，隨后參照1.3.4初篩所述方法，測定不同乳酸菌制備的發(fā)酵乳對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

1.3.6 菌株的鑒定

將菌株送至中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)進行生理生化與16S rDNA等菌株分型的相關(guān)測定。

1.3.7 發(fā)酵條件對BD3526產(chǎn)α-GI的影響

參照1.3.4初篩所述方法，在接種后，置于30 ℃和37 ℃條件下分別進行厭氧(靜置)和好氧(180 rpm搖床振蕩)培養(yǎng)24 h得發(fā)酵乳，進而檢測并比較兩者的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.8 傳代穩(wěn)定性實驗

將復(fù)篩獲得的菌株以每周一次頻率的傳代25次，參照1.3.4初篩所述方法，以原代菌株為對照，檢測第5、10、15、20和25代菌株所制備的發(fā)酵乳的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3.9 BD3526在脫脂乳中的發(fā)酵特性

將發(fā)酵種子以2%(v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 rpm搖床振蕩培養(yǎng)，于0、3、6、9、12、24、36 h取樣，觀察發(fā)酵過程中脫脂乳的顏色變化，并測定不同菌株發(fā)酵上清的pH、活菌數(shù)、糖苷酶抑制率及其凍干粉的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用Excel 2013和Origin Pro 2016進行數(shù)據(jù)匯總、分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 降糖菌株的初篩與復(fù)篩

利用逐級稀釋與涂布相結(jié)合的方法，在M17平板上共分離純化獲得38株菌株，將上述菌株分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，僅16株菌可代謝脫脂乳引起凝乳，進一步對這些菌株的發(fā)酵乳進行糖苷酶抑制活性的測定，部分篩選結(jié)果如圖1所示。

圖1 部分降糖菌株的初篩和復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Partial results of primary and secondary screening for anti-diabetic strains

初篩和復(fù)篩結(jié)果顯示，大部分受試菌株的發(fā)酵乳上清對α-葡萄糖苷酶的抑制率較低(<40%)，而BD3526的抑制效果穩(wěn)定維持在60%(初篩67%、復(fù)篩64%)以上，顯著高于其他菌株，因此，BD3526被選擇作為潛在的降血菌株來進一步研究。

2.2 BD3526與其他乳酸菌的比較

為了比較BD3526與其他酸奶發(fā)酵劑所制備的發(fā)酵乳對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，研究人員將BD3526及多種常規(guī)乳酸菌(如ST-BODY-3、LB340等)分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，所得發(fā)酵乳對α-葡萄糖苷酶的抑制率如下圖所示。

來自不同菌株的發(fā)酵乳對α-葡萄糖苷酶的抑制率差異較大，其中大部分常規(guī)乳酸菌的糖苷酶抑制活力較低(<20%)，具體地，保加利亞乳桿菌LB340、雙歧桿菌BL-04、嗜熱鏈球菌ST-BODY-3、嗜酸乳桿菌NCFM、腸膜明串珠菌BD1710、檸檬明串珠菌BD1707以及瑞士乳桿菌BD3809的抑制率分別為13%、2%、11%、5%、6%、10%和14%，僅有少數(shù)幾株菌具有一定的體外糖苷酶抑制活性，其中干酪乳桿菌ATCC334與鼠李糖乳桿菌LGG發(fā)酵乳的抑制活力較強，為22%和25%，而BD3525發(fā)酵乳的抑制效果最為佳，高達(dá)66%，顯著優(yōu)于其他受試乳酸菌。

圖2 不同乳酸菌對α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.2 Inhibitory effects of different lactic acid bacteria on α-glucosidase

BD3526生理生化、16S rDNA等分類數(shù)據(jù)及命名的依據(jù)，此前已有公開，結(jié)果顯示，BD3526為一株類芽孢桿菌新種，命名為Paenibacillusbovis(牛類芽孢桿菌)，并且該菌株成為該種的模式菌株[6]。相較于其他產(chǎn)α-GI微生物(干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌[7])而言，有關(guān)類芽孢桿菌，尤其是牛類芽孢桿菌發(fā)酵脫脂乳、產(chǎn)α-GI的研究還未曾有過披露，因此，此類研究值得進一步深入開展。

2.3 產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑特性

2.3.1 發(fā)酵條件對BD3526產(chǎn)α-GI的影響

不同溫度(30 ℃、37 ℃)與通氧(好氧、厭氧)組合條件下獲得的BD3526發(fā)酵乳對α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50如圖3所示。比較后發(fā)現(xiàn)，相同通氧條件下，30 ℃發(fā)酵乳的抑制活性高于37 ℃發(fā)酵乳，并且前者的IC50值低于后者，而在相同溫度下，來自搖床培養(yǎng)的發(fā)酵乳的抑酶活性顯著優(yōu)于靜置培養(yǎng)。由此可見，中溫、好氧是BD3526代謝脫脂乳產(chǎn)α-GI的優(yōu)選條件，該條件與類芽孢桿菌家族菌株(如多粘類芽孢桿菌等)的最適生長條件一致[8]，因此，根據(jù)糖苷酶抑制效果與菌體生長的正相關(guān)性推測，該抑制劑有可能是BD3526菌體生長過程中的代謝產(chǎn)物之一。

2.3.2 傳代穩(wěn)定性

某些微生物(如鏈霉菌[9]、乳酸菌[10]等)在傳代過程中存在著遺傳不穩(wěn)定性現(xiàn)象，而這種現(xiàn)象往往會對微生物的諸多表型產(chǎn)生負(fù)面影響，尤其是那些具有潛在商業(yè)價值的菌株在發(fā)生退化后特定功能性物質(zhì)的產(chǎn)量顯得極不穩(wěn)定，進而給科學(xué)研究和商業(yè)化應(yīng)用帶來很大煩惱。因此，本研究以原代作為對照，對第5、10、15、20和25代BD3526菌株發(fā)酵乳的糖苷酶抑制效果進行測定，旨在考察BD3526在α-GI產(chǎn)量方面的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。

圖3 發(fā)酵條件對BD3526產(chǎn)α-GI的影響Fig.3 Effect of fermentation conditions on α-GI by BD3526

圖4 BD3526產(chǎn)α-GI的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of BD3526 for α-GI production

不同傳代次數(shù)所得的BD3526發(fā)酵乳的α-葡萄糖苷酶抑制效果基本維持不變，無論抑制率(87%～93%)還是IC50(25.4～27.1 mg/mL)，均與原代株(91%，26.8 mg/mL)保持在同一水平范圍。由此可見，BD3526連續(xù)傳代25次后在產(chǎn)α-GI方面的遺傳性狀穩(wěn)定有效。

2.4 BD3526在SKM中的發(fā)酵特性

在發(fā)酵初期(0～6 h)，BD3526發(fā)酵乳呈典型的乳白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵體系顏色逐漸加深，最終變成棕色。前期相關(guān)報道指出，BD3526可產(chǎn)生一種高凝乳活性的金屬蛋白酶[11-14]，上述變色現(xiàn)象的產(chǎn)生很可能是該蛋白酶水解乳蛋白后釋放出的大量肽和氨基酸，與發(fā)酵體系中原有的乳糖等還原性糖，發(fā)生了美拉德反應(yīng)[15](又稱“非酶棕色化反應(yīng)”)所造成的。因此，發(fā)酵體系的顏色與乳蛋白的水解程度呈正相關(guān)性，顏色越深，則水解程度越高，反之亦然。

圖5 BD3526在脫脂乳中生長時的pH和活菌數(shù)變化Fig.5 Variation of pH and viable counts of BD3526 grown in SKM

BD3526在脫脂乳中的活菌數(shù)與pH變化如圖5所示，在發(fā)酵前期，BD3526在脫脂乳中的生長趨勢與保加利亞乳桿菌等乳酸菌類似，呈典型的“S”型生長曲線，尤其在6～9 h時，菌體由于生境營養(yǎng)充足且活力旺盛的關(guān)系，導(dǎo)致增殖速率最快(活菌對數(shù)值8.18→9.01)，直至12 h時達(dá)到活菌數(shù)峰值1.75×109CFU/mL，隨著發(fā)酵時間的延長，活菌總數(shù)開始緩慢下滑至2.5×108CFU/mL(24 h)，并一直保持至發(fā)酵終點(36 h)，這是前期的高速代謝作用透支了發(fā)酵體系中的營養(yǎng)物質(zhì)，并積累了某些不利于菌體生長的代謝產(chǎn)物的必然結(jié)果。

在pH變化方面，BD3526發(fā)酵體系的pH快速降低現(xiàn)象(pH6.23→5.56)主要出現(xiàn)在發(fā)酵前12 h，繼續(xù)延長發(fā)酵時間至36 h并未發(fā)現(xiàn)有機酸的大量產(chǎn)生與進一步積累，其發(fā)酵終點pH為5.43。該現(xiàn)象的產(chǎn)生與常規(guī)乳酸菌完全不同，后者的發(fā)酵乳終點pH較低(5.0以下)主要得益于乳酸的大量積累，而BD3526發(fā)酵乳pH較高，除了少量乳酸的貢獻外，菌株自身分泌的多種乳蛋白水解酶將酪蛋白水解成偏酸性的肽和氨基酸也可能是影響pH的重要因素之一。

圖6 為發(fā)酵過程中BD3526發(fā)酵乳的糖苷酶抑制率和IC50變化。受到發(fā)酵前期活菌總量較低而引起代謝作用不足的影響，3 h發(fā)酵乳中抑制劑含量較低，其糖苷酶的抑制效果僅為8%(其IC50不可測)，延長發(fā)酵時間后發(fā)現(xiàn)，各取樣點發(fā)酵乳(6、9、12、24、36 h)的糖苷酶抑制活性顯著提高，分別為83%、91%、93%、92%、91%，各樣品組的測定值處于高水平且無明顯差異。但進一步分析顯示各樣品組的IC50差別巨大，伴隨發(fā)酵程度的加深，發(fā)酵乳IC50不斷遞減，具體為： 45 mg/mL(6 h)、40.4 mg/mL(9 h)、35 mg/mL(12 h)、26.8 mg/mL(24 h)和22.4 mg/mL(36 h)，意味著體系中α-GI正逐步積累，這可能是發(fā)酵體系中BD3526菌體總量大、菌株活性高，轉(zhuǎn)化效率強、積累速率快等多種作用的綜合結(jié)果。

圖6 BD3526在脫脂乳中生長時的糖苷酶抑制率和IC50變化Fig.6 Variation of α-glucosidase inhibitory and IC50 of BD3526 grown in SKM

3 結(jié)論

有關(guān)α-GI的研究最早可追溯至上世紀(jì)中期，據(jù)統(tǒng)計，已報道的降糖微生物中真菌類微生物占70%以上，如放線菌[16]、霉菌[17]等因研究起步早而分離線路成熟，活性物質(zhì)明確，作用機制清晰。相比之下，細(xì)菌類微生物的相關(guān)研究尚處于的起步階段(菌株篩選[7]、技術(shù)路線的摸索[18]等)。類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)細(xì)菌曾歸于芽孢桿菌屬(Bacillus)內(nèi)，于1993年由Ash等利用PCR探針技術(shù)才將其獨立為新屬[19]，并確立多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)為其模式菌株，此類菌株兼性厭氧，嗜中溫、中性pH生長，具有抗菌、固氮、土壤磷增溶、促微生物生長[20]等多種生物活性，然而，有關(guān)類芽孢桿菌發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)α-GI的研究幾乎沒有，該領(lǐng)域的空白現(xiàn)狀為本研究提供了契機。

本文以體外模型為檢測手段，對西藏生牦牛乳來源的菌株進行初篩和復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)，一株類芽孢桿菌新種PaenibacillusbovisBD3526具有代謝脫脂乳、產(chǎn)α-GI的能力，該菌株發(fā)酵乳的糖苷酶抑制活性(>60%)顯著高于其他牦牛乳分離菌株和常規(guī)乳酸菌，中溫、好氧發(fā)酵有利于該菌株更好地合成與積累活性物質(zhì)，30 ℃、180 rpm搖床振蕩培養(yǎng)24 h的發(fā)酵乳對α-葡萄糖苷酶的抑制率可達(dá)91%，IC50為26.8 mg/mL。傳代25次的BD3526的降糖效果與原代保持在同一水平，表明菌株產(chǎn)α-GI的遺傳性狀穩(wěn)定有效。當(dāng)BD3526在脫脂乳中發(fā)酵時，發(fā)酵乳的顏色因受到美拉德反應(yīng)的影響而由淺及深，12 h發(fā)酵乳中活菌總數(shù)達(dá)到峰值1.75×109CFU/mL，發(fā)酵終點pH為5.43，產(chǎn)酸能力顯著低于乳酸菌，6 h后的發(fā)酵乳的糖苷酶抑制活性均處于高水平(80%以上)，但不斷遞減的IC50表明，α-GI伴隨發(fā)酵程度的加深，依然在進一步積累，因此，后期有必要對BD3526在發(fā)酵條件進行全面優(yōu)化，從而為后期的分離、純化工作打下基礎(chǔ)。