朱 淼，侯怡鈴，唐 賢，宋志強，丁 祥

1西華師范大學生命科學學院；2西華師范大學環(huán)境科學與工程學院，南充 637009

真菌多糖為天然的高分子化合物，對細胞的分裂分化及生長衰老具有重要作用[1]，因其所具有的生物活性及藥理價值而成為當今研究的熱點[2]。鵝膏菌屬(Amanita)是大型真菌中一個種類繁多、分布廣泛的種屬，其多糖備受關注并已有廣泛的研究。Ruthes等[3]發(fā)現(xiàn)，毒蠅鵝膏多糖具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用；Karaman等[4]研究發(fā)現(xiàn)，松果鵝膏多糖具有鎮(zhèn)痛作用，并能較好地清除OH-；Tang等[5]發(fā)現(xiàn)，黃蓋鵝膏多糖和豹斑毒鵝膏多糖能夠抑制人胃癌細胞(MGC)的生長；祝雪嬌等[6]發(fā)現(xiàn)，紅黃鵝膏多糖具有抗腫瘤活性，能夠抑制小鼠黑色素瘤細胞(B16)的生長。以上研究均是對鵝膏菌屬中所含粗多糖的報道，但對其所含多糖的精細結構并未表征，因此相關活性及其分子機制研究存在一定的不確定性。

橙蓋鵝膏(Amanitacaesarea)是鵝膏菌屬(Amanita)的一種食用真菌，菌蓋為橙色，也被稱為“雞蛋菌”。在我們前期的研究中，從采摘于四川的橙蓋鵝膏子實體中提取了一種結構新穎的多糖(AC-1)(圖1)，重均分子量Mw為19 329 Da。其精細結構特征是以α-(1→4)-D-葡萄糖和α-(1→3)-D-葡萄糖為骨架，α-(1→3)-D-葡萄糖6-C上連接一個→1)-α-D-來蘇糖的側(cè)鏈，α-D-葡萄糖和α-D-來蘇糖的比例為2∶1[7]。然而，關于該橙蓋鵝膏多糖的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的研究目前未見報道。本實驗以橙蓋鵝膏多糖(AC-1)為研究對象，探究其對三種免疫細胞(T細胞、B細胞和RAW264.7)、小鼠成纖維細胞(L929)、小鼠胃癌細胞(MFC)和小鼠肉瘤細胞(S180)的影響。希望通過研究能夠進一步明確橙蓋鵝膏多糖的體外免疫調(diào)節(jié)、細胞毒性和抗腫瘤活性，為開發(fā)利用橙蓋鵝膏多糖資源提供一定的參考依據(jù)。

圖1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)的結構Fig.1 The structure of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

橙蓋鵝膏菌(Amanitacaesarea)采自于四川省甘孜州，橙蓋鵝膏多糖(AC-1)參考文獻[7]的方法制備。T細胞、B細胞、小鼠腹腔巨噬細胞(RAW264.7)、小鼠成纖維細胞(L929)、小鼠胃癌細胞(MFC)和小鼠肉瘤細胞(S180)由中科院上海生命科學研究院生化與細胞所提供。

1.2 主要試劑和實驗儀器

PRMI 1640培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶(Gibco)、脂多糖(LPS)購于Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑)購于美國ZETA LIFE公司；中性紅試劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司；甘露聚糖肽(Mannatide)購于成都利爾藥業(yè)有限公司；ELISA檢測試劑盒購于R&D公司；無水乙醇購于河南天冠集團，乙酸購于江蘇索普公司；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific)；Multiskan Go型酶標儀(Thermo scientific)。

1.3 實驗方法

1.3.1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對三種免疫細胞(T細胞、B細胞和巨噬細胞RAW264.7)增殖的影響

將細胞用培養(yǎng)液稀釋至1×105/mL，然后以每孔100 μL加入96孔板。實驗設置空白對照組，AC-1藥物組(設置1.25、2.5、5、10 μg/mL 共4個終濃度梯度)，LPS陽性對照組(終濃度為5 μg/mL)，每個濃度6個重復。參照文獻[8]的方法檢測AC-1對三種免疫細胞的增殖效應并記錄實驗結果。

增殖率(%)=[OD值(實驗組)-OD值(空白

對照組)]/OD值(空白對照組)×100%

注：實驗組為AC-1藥物組和LPS陽性對照組。

1.3.2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B細胞分泌抗體的影響

本實驗用ELISA試劑盒檢測AC-1刺激B細胞分泌的抗體Ig A、Ig M、Ig G和Ig E[9]。實驗設置空白對照組，AC-1藥物組(2.5、5、10 μg/mL)和LPS陽性對照組(5 μg/mL)，按照試劑盒說明書操作。用酶標儀在450 nm波長處測定各孔吸光度值(OD值)，記錄實驗結果。

1.3.3 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對巨噬細胞RAW264.7細胞吞噬能力的影響

取巨噬細胞RAW264.7用培養(yǎng)液稀釋至5×105/mL[10]，然后以每孔100 μL的劑量加入96孔板中，37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，依次加入100 μL細胞培養(yǎng)液(空白對照)、終濃度為1.25、2.5、5、10 μg/mL的橙蓋鵝膏多糖(AC-1)溶液(AC-1藥物組)、終濃度為5 μg/mL的LPS溶液(陽性對照組)，每組6個重復，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸出上清，每孔中加入100 μL的0.075%的中性紅試劑，在培養(yǎng)箱中孵育15 min。15 min后，用PBS洗三次，然后每孔分別加入100 μL細胞裂解液(由無水乙醇和乙酸按1∶1的體積比配制而成)，培養(yǎng)箱中裂解2 h，利用酶標儀在540 nm波長下測OD值，并記錄實驗結果。

1.3.4 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠成纖維細胞(L929)的細胞毒性實驗

實驗參照1.3.1中AC-1對三種免疫細胞增殖影響的方法檢測AC-1對小鼠成纖維細胞(L929)的細胞毒性實驗，AC-1藥物組設置5、10、15、20 μg/mL共4個終濃度梯度，其余步驟同1.3.1。

1.3.5 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠胃癌細胞(MFC)和小鼠肉瘤細胞(S180)的體外抑制

將配好的細胞懸液以每孔100 μL的劑量加入96孔板中培養(yǎng)24 h后，依次加入100 μL細胞培養(yǎng)液(空白對照)、終濃度為5、10、15、20 μg/mL的AC-1溶液(AC-1藥物組)，終濃度為5 μg/mL的甘露聚糖肽(Man)溶液(陽性對照組)后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用酶標儀在450 nm波長下測OD值，并記錄實驗結果。

抑制率(%)=[OD值(空白對照組)-OD值

(實驗組)]/OD值(空白對照組)×100%

注：實驗組為AC-1藥物組和Man陽性對照組。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 19軟件進行統(tǒng)計學處理，差異分析采取單因素方差分析，與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。

2 實驗結果

2.1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)體外免疫調(diào)節(jié)活性

2.1.1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對T淋巴細胞增殖的影響

T細胞是在胸腺分化成熟的一類免疫細胞，它通過輔助激活B細胞以及產(chǎn)生細胞因子等方式參與機體免疫。AC-1對T細胞增殖的作用如圖2所示，AC-1的終濃度為1.25～10 μg/mL時，均能夠促進T細胞的增殖(P<0.01)，且低中等濃度的AC-1對T細胞增殖效應較好。細胞與藥物共培養(yǎng)24 h后T細胞的生長形態(tài)如圖3所示，正常生長的T細胞懸浮生長、成團較小。在濃度為1.25～10 μg/mL時，T細胞生長狀態(tài)良好，數(shù)量增多，成團變大。以上結果表明，AC-1可極顯著刺激T細胞的增殖及成團，在機體的細胞免疫方面具有重要的作用。

圖2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對T淋巴細胞增殖的影響Fig.2 Effect on the proliferation of T cells by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖3 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對T細胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect on T cells morphology by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為1.25、2.5、5、10 μg/mL，6為LPS陽性對照組(5 μg/mL)，細胞放大倍數(shù)(10 ×20)。Note:1 was control group.2-5 were AC-1 group,the final concentration were 1.25,2.5,5,10 μg/mL,respectively.6 was LPS positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10 ×20)

2.1.2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B淋巴細胞增殖的影響

B細胞是在骨髓中發(fā)育和分化的一種淋巴細胞，能夠參與機體的體液免疫，對于維持機體的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。AC-1對B細胞增殖的影響如圖4所示，AC-1的終濃度為1.25～10 μg/mL時均能夠促進B細胞的增殖，且濃度為5 μg/mL時促進B細胞增殖的效應最好。同等濃度下(5 μg/mL)，B細胞在AC-1作用下的增殖率(36.98%)高于LPS作用下的增殖率(17.30%)。細胞與藥物共培養(yǎng)24 h后B細胞的生長形態(tài)如圖5所示，在AC-1濃度為1.25～5 μg/mL時，隨著濃度的增加，B細胞的數(shù)量增多，成團變大。以上結果表明，AC-1可顯著刺激B細胞的增殖及成團，在機體的體液免疫方面具有重要的作用。

圖4 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B淋巴細胞增殖的影響Fig.4 Effect on the proliferation of B cells by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖5 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B細胞形態(tài)的影響Fig.5 Effect on B cells morphology by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為1.25、2.5、5、10 μg/mL，6為LPS陽性對照組(5 μg/mL)，細胞放大倍數(shù)(10 ×20)。Note:1 was control group.2-5 were AC-1 group,the final concentration were 1.25,2.5,5,10 μg/mL,respectively.6 was LPS positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10×20).

2.1.3 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B細胞分泌抗體的影響

B淋巴細胞在抗原的刺激下分化形成漿細胞，漿細胞分泌的抗體能夠?qū)⑷肭值目乖M行清除。借助ELISA檢測試劑盒，我們對B細胞分泌抗體的情況進行了統(tǒng)計，結果如圖6至圖9所示，在濃度為2.5～10 μg/mL范圍內(nèi)，AC-1能夠促進B淋巴細胞分泌Ig A、Ig E、Ig G和Ig M抗體，但促進Ig A和Ig G抗體分泌的最適濃度為10 μg/mL，而促進Ig E、Ig M抗體分泌的最適濃度為2.5 μg/mL。

2.1.4 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖的影響

巨噬細胞是比較特殊的一類免疫細胞，它既能參與機體的固有免疫，也能參與機體的特異性免疫，在免疫系統(tǒng)中具有重要的作用。AC-1對RAW264.7的效應如圖10所示，AC-1的終濃度為1.25～10 μg/mL時，均能夠促進RAW264.7的增殖，在濃度為5 μg/mL時對RAW264.7的增殖效應最好。細胞與藥物共培養(yǎng)24 h后RAW264.7的生長形態(tài)如圖11所示，正常狀態(tài)下的巨噬細胞貼壁生長并呈橢圓形，在濃度為1.25～10 μg/mL時，RAW264.7伸出偽足的細胞數(shù)量明顯增多，該結果提示AC-1能夠活化RAW264.7細胞，在機體的固有免疫和特異性免疫方面具有重要的作用。

圖6 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B細胞分泌Ig A抗體的影響Fig.6 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on secretion of Ig A antibody from B cells注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖7 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B細胞分泌Ig E抗體的影響Fig.7 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on secretion of Ig E antibody from B cells注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖8 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B細胞分泌Ig G抗體的影響Fig.8 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on secretion of Ig G antibody from B cells注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖9 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對B細胞分泌Ig M抗體的影響Fig.9 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on secretion of Ig M antibody from B cells注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖10 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.10 Effect on the proliferation of RAW264.7 cells by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

2.1.5 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的影響

AC-1對RAW264.7吞噬中性紅能力的影響如圖12所示，當AC-1的終濃度為1.25～10 μg/mL時均能夠促進巨噬細胞吞噬中性紅(P<0.01)，最適濃度為2.5 μg/mL，此時吞噬率可達89.50%。同等濃度下(5 μg/mL)，AC-1刺激下RAW264.7的吞噬率(69.69%)高于LPS刺激下的吞噬率(19.34%)。以上結果進一步表明AC-1不僅能顯著刺激RAW264.7增殖，還能顯著增強RAW264.7的吞噬功能，在激活機體免疫、維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要的作用。

圖11 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對RAW264.7細胞形態(tài)的影響Fig.11 Effect on RAW264.7 cells morphology by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為1.25、2.5、5、10 μg/mL，6為LPS陽性對照組(5 μg/mL)，細胞放大倍數(shù)(10×20)。Note:1 was control group.2-5 were AC-1 group,the final concentration were 1.25,2.5,5,10 μg/mL,respectively.6 was LPS positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10×20).

圖12 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對巨噬細胞RAW264.7吞噬中性紅能力的影響Fig.12 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on the ability of macrophages to phagocytose neutral red注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

2.2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠成纖維細胞(L929)的細胞毒性實驗

L929細胞為小鼠成纖維細胞，貼壁生長，是細胞毒理性實驗的常用細胞。本實驗以L929細胞為模型探究AC-1對正常細胞的毒性作用，實驗結果如圖13所示，在AC-1的濃度為5～20 μg/mL時對L929細胞無顯著的增殖及抑制作用，說明AC-1對正常細胞無毒性。

2.3 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)體外抗腫瘤活性

2.3.1 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠胃癌細胞(MFC)生長的影響

胃癌是對人類健康有危害的惡性腫瘤之一，致死率在全部惡性腫瘤中排第二位。AC-1對MFC細胞的影響如圖14所示，AC-1在終濃度為10～20 μg/mL時能夠抑制MFC細胞的生長(P<0.01)。并且當AC-1濃度為20 μg/mL時抑制率高達30.09%。細胞與藥物共培養(yǎng)24 h后MFC的形態(tài)如圖15所示，當AC-1濃度為10～20 μg/mL時，隨著濃度的增加，細胞的數(shù)量逐漸變小，細胞之間的間隙變大，提示AC-1在濃度為10～20 μg/mL時能夠?qū)FC細胞骨架產(chǎn)生一定的影響，且隨著濃度的增加，效果越明顯。

2.3.2 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠肉瘤細胞(S180)生長的影響

S180為小鼠肉瘤細胞(腹水瘤細胞系)，通常作為抗腫瘤活性實驗的研究對象。AC-1對S180細胞的影響如圖16所示，當AC-1的終濃度為5～20 μg/mL時均可顯著抑制S180細胞的生長(P<0.05)。細胞與藥物共培養(yǎng)24 h后S180細胞生長形態(tài)如圖17所示，AC-1在終濃度為10～20 μg/mL時，隨著濃度的增加，細胞之間的間隙變大，提示AC-1在濃度為10～20 μg/mL時能夠直接對S180細胞產(chǎn)生抑制效果，并能夠?qū)180細胞骨架產(chǎn)生一定的影響，但其抑制效果相對于MFC細胞較弱，提示AC-1對于不同的腫瘤細胞具有不同的抑制效果，其相關機制有待進一步研究。

圖13 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠成纖維細胞(L929)的影響Fig.13 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on the mouse fibroblast (L929)注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖14 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠胃癌細胞(MFC)的影響Fig.14 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on the gastric cancer cells (MFC)注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

圖15 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠胃癌細胞(MFC)形態(tài)的影響Fig.15 Effect on gastric cancer cells (MFC) morphology by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為5、10、15、20 μg/mL，6為Man陽性對照組(5 μg/mL)，細胞放大倍數(shù)(10×20)。 Note:1 was control group.2-5 were AC-1 group,the final concentration were 5,10,15,20 μg/mL,respectively.6 was Man positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10×20).

圖16 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠肉瘤細胞(S180)的影響Fig.16 Effect of Amanita caesarea polysaccharide (AC-1) on the mouse sarcoma cells (S180)注：與空白對照組相比，P<0.05為差異性顯著，用“*”表示；P<0.01為差異性極顯著，用“**”表示。Note:Compared with control group,P<0.05 was significant difference,expressed by “*”;P<0.01 was extremely significant,expressed by “**”.

3 結論

本實驗以從四川采摘的橙蓋鵝膏子實體中提取的結構新穎的多糖AC-1為研究對象，探究了其體外免疫調(diào)節(jié)活性、細胞毒性和抗腫瘤活性。實驗結果表明，AC-1能夠在體外促進三種免疫細胞(B、T和RAW264.7)的增殖、巨噬細胞的吞噬及B細胞分泌抗體?？贵w分泌實驗表明，AC-1在較低濃度下促進Ig E分泌的效果更明顯，而在較高濃度下促進Ig G的分泌效果最明顯，提示AC-1在較低濃度下主要通過促進Ig E介導的超敏反應來發(fā)揮體液免疫功能，而在較高濃度下則是通過增強Ig G介導的吞噬調(diào)理等作用發(fā)揮體液免疫功能。AC-1也能在體外抑制小鼠胃癌細胞(MFC)和小鼠肉瘤細胞(S180)增殖，且對正常細胞無抑制作用，但對S180細胞的抑制效果較MFC細胞弱，提示AC-1無細胞毒性且具有良好的體外免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，但對不同的腫瘤細胞具有不同的抑制效果。

圖17 橙蓋鵝膏多糖(AC-1)對小鼠肉瘤細胞(S180)形態(tài)的影響Fig.17 Effect on morphology of the Mouse sarcoma cells (S180) by Amanita caesarea polysaccharide (AC-1)注：1為空白對照組，2～5為AC-1藥物組，其終濃度分別為5、10、15、20 μg/mL，6為Man陽性對照組(5 μg/mL)，細胞放大倍數(shù)(10×10)。 Note:1 was control group,2-5 were AC-1 group,the final concentration were 5,10,15,20 μg/mL,respectively,6 was Man positive control group (5 μg/mL),cell magnification (10×10).

張茜[11]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖和銀耳多糖在低于10 μg/mL不能促進巨噬細胞RAW264.7的增殖，也不能促進T、B細胞增殖。而本實驗的橙蓋鵝膏多糖(AC-1)在1.25～10 μg/mL都能刺激B、T細胞和RAW264.7的增殖，提示AC-1在此濃度下免疫增殖效果要優(yōu)于香菇多糖和銀耳多糖。巨噬細胞是重要的抗原遞呈細胞，而吞噬功能是巨噬細胞發(fā)揮遞呈抗原功能的基礎，本實驗結果還表明AC-1能夠促進巨噬細胞的吞噬，增強其抗原遞呈功能。體外抗腫瘤活性實驗比較，AC-1在濃度為20 μg/mL時，對小鼠胃癌細胞(MFC)的抑制率為30.09%，高于黃蓋鵝膏多糖濃度為40 μg/mL時對人胃癌細胞(MGC)的抑制率16.47%[5]，造成這兩種多糖活性的差異的原因可能與兩者的結構、分子量以及純度等具有較大的關系。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，在濃度為2.5～10 μg/mL范圍內(nèi)，AC-1能夠促進B淋巴細胞分泌Ig A、Ig E、Ig G和Ig M抗體，但促進Ig A和Ig G抗體分泌的最適濃度為10 μg/mL，而促進Ig E、Ig M抗體分泌的最適濃度為2.5 μg/mL，該結果提示不同濃度的橙蓋鵝膏多糖(AC-1)能導致B淋巴細胞分泌免疫球蛋白(Ig)發(fā)生類別轉(zhuǎn)換。Ig類別轉(zhuǎn)換是指在抗原或共刺激分子的作用下導致B細胞發(fā)生由產(chǎn)生Ig M抗體向產(chǎn)生Ig A、Ig G和Ig E轉(zhuǎn)變的行為[12]。Ig類型的轉(zhuǎn)換會受局部微環(huán)境和細胞因子的影響和調(diào)節(jié)，例如低濃度的卵清蛋白(OVA)主要誘導產(chǎn)生Ig E和Ig G1，高濃度卵清蛋白(OVA)主要誘導產(chǎn)生Ig G2a[13]；低濃度的竹節(jié)參醇提物(HBsAg)主要誘導產(chǎn)生Ig G1，而高濃度的竹節(jié)參醇提物(HBsAg)主要誘導產(chǎn)生Ig G2b[14]；同樣，IL-4在低濃度時主要誘導產(chǎn)生Ig G1，而在高濃度時則主要誘導產(chǎn)生Ig E[15]。本實驗結果顯示，AC-1在濃度為2.5 μg/mL時能誘導B細胞分泌的Ig向Ig E、Ig M類別轉(zhuǎn)換，而在濃度為10 μg/mL時能誘導B細胞分泌的Ig向Ig A、Ig G類別轉(zhuǎn)換，相關分子機制有待進一步研究。

一般認為，以β-(1→3)(1→6)或以β-(1→4)(1→6)糖苷鍵連接的多糖活性較強，因為此種構型有利于形成三股繩狀螺旋立體構型，顯示較高的免疫活性和抗腫瘤活性[16]。例如以β-(1→3)-D葡聚糖為主鏈的香菇多糖、豬苓多糖和奇果菌多糖均具有提高機體免疫和抗腫瘤的功能[16]；也有研究表明，以α-D葡聚糖為主的多糖也具有抗腫瘤活性，如對多種腫瘤細胞的生長均具有抑制作用的松茸多糖就以α-(1→6)-D葡萄糖為主鏈[17]，本研究結果表明以α-(1→4)和α-(1→3)-D葡萄糖為主鏈的AC-1也具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，提示多糖的活性也受到側(cè)鏈單糖種類和高級結構的影響。

真菌多糖具有多種生物活性，但具體發(fā)揮哪種活性與細胞內(nèi)信號傳遞密切相關。例如具有β-(1→3)-D葡聚糖主鏈的香菇多糖，能夠通過MyD88依賴的NF-кB途徑解除免疫抑制[18]；具有β-(1→3)和β-(1→6)-D葡聚糖的茯苓多糖，通過NF-кB/MAPK信號通路激活巨噬細胞釋放NO[19]；具有β-(1→3)和β-(1→6)葡聚糖的灰花樹多糖通過Dectin-1/Sky/NF-кB信號通路活化巨噬細胞，使其分泌TNF-α和IL-6，達到抑瘤效果[20]。綜上可以看出，NF-кB途徑在β-葡聚糖發(fā)揮免疫作用中扮演重要的角色，然而NF-кB在以α-D-葡萄糖為主鏈的AC-1發(fā)揮生物活性時是否具有同樣的作用，則有待進一步進行探究。

本實驗結果表明：AC-1具有在體外增強免疫應答和抑制腫瘤細胞生長的功能，且對正常細胞無毒副作用，這為橙蓋鵝膏多糖(AC-1)作為抗腫瘤藥物的開發(fā)利用提供了科學依據(jù)，但其與細胞表面的何種受體結合以及信號如何進行傳遞則有待進一步探究。