楊 欣，李亞輝，劉 明，呂潤霖，錢海兵

貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025

中藥趕黃草最早載于《救荒本草》，為苗族民間治療肝病的常用藥，主要分布在四川、貴州、湖南等地，具有清熱解毒、退黃化濕，活血散瘀，利水消腫之功效，以全草入藥[1]。目前，已有多項研究表明，趕黃草的多種活性成分具有保肝作用，對肝臟功能有調(diào)節(jié)作用，特別是對酒精性脂肪肝、肝纖維化和肝硬化有顯著治療作用[2]。中藥材在保肝上凸顯重要優(yōu)勢[3]，但是中藥材化學(xué)成分多，需要通過大量工作篩選保肝的活性成分及靶點。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)的出現(xiàn)，多學(xué)科的相互交叉，給中醫(yī)藥的發(fā)展增添新思想和新技術(shù)，同時減少了實驗工作量和實驗成本[4]。趕黃草具有保肝的作用，但是其揮發(fā)油的藥理作用的機(jī)制尚未研究全面。本研究基于分析化學(xué)結(jié)合計算機(jī)輔助藥物設(shè)計探討趕黃草揮發(fā)油在保肝上的應(yīng)用，為趕黃草產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

分子對接(molecular docking)可以解釋活性成分與靶標(biāo)的作用機(jī)制，從空間結(jié)構(gòu)上揭示化合物結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(structure-aactivity relationship，SAR)[5]，最終目標(biāo)篩選出關(guān)鍵活性成分及靶點，為藥理、細(xì)胞和動物實驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：趕黃草(PenthorumchinensePursh)采自四川瀘州古藺，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院魏升華教授奠定為扯根菜屬PenthorumGronov.ex L.植物扯根菜PenthorumchinensePursh的干燥地上部分，密封室溫放置樣本室，編號為201812005，備用。

試劑：正己烷(南京復(fù)優(yōu)化工貿(mào)易有限公司，色譜純)；無水硫酸鈉(上海弘順生物科技有限公司)。

儀器：電熱套(KDM-2000，江蘇杰瑞爾電器有限公司)；氣質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 6890/5975C，美國Agilent公司)；電子天平 (UX2200H，日本島津公司)；揮發(fā)油提取器(廈門海標(biāo)科技有限公司)；LK-400A搖擺式中藥粉碎機(jī)(LK-400A，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 趕黃草揮發(fā)油的提取及樣本處理

趕黃草(四川瀘州)揮發(fā)油基于水蒸氣蒸餾法(steam distillation，SD)提取，取干燥的趕黃草100 g，粉碎，置于2 L 圓底燒瓶中，混合均勻，連續(xù)提取5 h，得到具有芳香氣味的透明油狀液體 1.8 mL，經(jīng)無水 Na2SO4干燥，備用[6]。

1.2.2 趕黃草揮發(fā)油成分的GC-MS 分析

取一定量的揮發(fā)油樣品，采用HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)進(jìn)行GC-MS分析。

色譜柱為FB-5MSI(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度48 ℃(保留2 min)，以4 ℃/min升溫至220 ℃，再以15 ℃/min升溫至310 ℃，保留5 min，運行時間：56 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流，分流比20∶1，溶劑延遲時間：5.0 min。

離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 659 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～450 amu。組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用NIST庫進(jìn)行定性分析，峰面積歸一法進(jìn)行定量分析。

1.2.3 靶標(biāo)蛋白篩選

趕黃草揮發(fā)油9個主要活性成分：香葉基丙酮，金合歡基丙酮，葉綠醇，二十三烷，二十四烷，二十五烷，二十六烷，二十七烷，2-硬脂酸單甘油酯靶點篩選基于SwissADME(http://www.swissadme)在線分析，每個活性成分預(yù)測出15個關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白[7,8]，包括蛋白名稱、基因名稱、基因ID等等。

1.2.4 生物功能分析

靶點GO功能分析基于DAVID 6.8(DAVID 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)在線分析，將70個靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，點擊限定物種為人源，設(shè)定閾值P<0.01，GO(Gene Ontology)注釋分析包含，即生物過程 (biological process，BP)、細(xì)胞組分 (cellular component，CC)以及分子功能 (molecular function，MF)。

1.2.5 Hub靶點篩選

基于Cytoscape3.5.1中的Cytohubba模塊[9，10]，依據(jù)度(degree)，邊過濾成分(edge percolated component，EPC)，最大鄰居組件(maximum neighborhood component，MNC)，最大團(tuán)中心性(maximal clique centrality，MCC)四種算法輸出hub基因。

1.2.6 疾病分析

將篩選出的hub基因進(jìn)行疾病分析，基于CTD(comparative toxicogenomics database)在線分析，以“CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB”為關(guān)鍵詞分別檢索相關(guān)疾病，選擇已經(jīng)有實驗驗證的 “T”的疾病進(jìn)行分析。

1.2.7 分子對接驗證分析及關(guān)鍵氨基酸位點

CNR1從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB(http://www.rcsb.org/pdb) 獲取 3D 晶體結(jié)構(gòu)，PDBID：5U09，晶體結(jié)構(gòu)在2.6?的解象下以X衍射的方法獲得。采用Surflex-Dock 模塊完成分子對接(標(biāo)準(zhǔn)模式)[11]，其他參數(shù)均采用 Sybyl默認(rèn)值，以 Total-Score 大于6為閾值，挑選對接效果好的化合物[12]?；贚igplot 1.4.5軟件進(jìn)行相互作用分析，結(jié)果以氫鍵、疏水作用輸出，篩選關(guān)鍵的氨基酸位點。

1.2.8 關(guān)鍵化學(xué)成分的ADME/T性質(zhì)

基于SwissADME(http://www.swissadme.ch/)進(jìn)行初期藥物開發(fā)毒性篩選。相關(guān)參數(shù)包括： CYP450酶的抑制性(cyp inhibitory promiscuity)、氫鍵供體數(shù)(h-bond donors,HBD)、氫鍵受體數(shù)(h-bond acceptors,HBA)、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(rotatable bonds，RBN)、分子量(molecular weight，MW)、脂水分配系數(shù)(mlogp)等。

2 實驗結(jié)果

2.1 揮發(fā)油化學(xué)成分

從GC-MS 分析結(jié)果(表1)可知，趕黃草揮發(fā)油共檢測出31種活性成分，占總峰面積的69.539%，主要化學(xué)成分有為香葉基丙酮(2.672%)，金合歡基丙酮(31.907%)，葉綠醇(2.392%)，二十三烷(4.01%)，二十四烷(5.487%)，二十五烷(5.04%)，二十六烷(3.552%)，二十七烷(2.621%)，2-硬脂酸單甘油酯(3.26%)，占總峰面積的62.733%，主要化學(xué)成分mol2結(jié)構(gòu)基于TCSMP(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺)進(jìn)行下載[13,14]，圖1為趕黃草揮發(fā)油主要活性成分(相對含量>2%)離子流圖。

圖1 揮發(fā)油主成分總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of main components of volatile oil注：10.香葉基丙酮；15.金合歡基丙酮；19.葉綠醇；21.二十三烷；22.二十四烷；23.二十五烷；24.二十六烷；25.二十七烷；26.2-硬脂酸單甘油酯。Note:10.Geranylacetone;15.Farnesylacetone;19.Phytol;21.Tricosane;22.Tetracosane;23.Pentacosane;24.Hexacosane;25.Heptacosane;26.2-Monostearin.

表1 揮發(fā)油化學(xué)成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Molecular formula分子量Molecular weight相對含量Relative percent (%)2349.31二十五烷 PentacosaneC25H523525.042450.01二十六烷 HexacosaneC26H543663.5522550.65二十七烷 HeptacosaneC27H563802.6212650.822-硬脂酸單甘油酯 2-MonostearinC21H42O43583.262751.23二十八烷 OctacosaneC28H583941.2092851.45角鯊烯 SqualeneC30H504100.6072951.82二十九烷 NonacosaneC29H604081.7683052.46三十烷 TriacontaneC30H624220.5223153.18三十一烷HentriacontaneC31H644370.36Total69.539

2.2 GO功能注釋分析

香葉基丙酮，金合歡基丙酮，葉綠醇，二十三烷，二十四烷，二十五烷，二十六烷，二十七烷，2-硬脂酸單甘油酯9個關(guān)鍵活性成分共篩選出135個靶標(biāo)蛋白，去掉重復(fù)靶標(biāo)蛋白，共有70個靶標(biāo)蛋白，基于DAVID對70個潛在靶點的GO功能注釋分析[15]，如表2、圖2所示，在生物過程中，70個靶點基因主要參與肽-酪氨酸脫磷酸化(peptidyl-tyrosine dephosphorylation)、血小板激活(platelet activation)等生物過程；主要分布在質(zhì)膜(plasma membrane)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)等；分子功能上，靶點基因主要有蛋白質(zhì)激酶c活性(protein kinase C activity)、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性(protein tyrosine phosphatase activity)、蛋白質(zhì)激酶結(jié)合(protein kinase binding)等功能。

表2 潛在靶點的GO功能注釋分析

續(xù)表2(Continued Tab.2)

GO注釋GO annotation 編號No.名稱Name百分比Percentage (%)P-value7Growth cone7.28.77E-048Integral component of membrane46.40.00139Perinuclear region of cytoplasm130.0019分子功能10Mitochondrial membrane5.80.005Molecular function1Glucuronosyltransferase activity131.82E-132Protein kinase c activity10.11.66E-113Transferase activity, transferring hexosyl groups8.71.20E-074Protein tyrosine phosphatase activity11.61.49E-075C-c chemokine receptor activity5.81.34E-056Protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity7.21.44E-057Protein kinase binding14.51.89E-058Chemokine receptor activity5.84.08E-059Calcium-independent protein kinase c activity4.34.78E-0510Calcium-dependent protein kinase c activity4.39.54E-05

圖2 潛在靶點的GO生物學(xué)過程富集分析Fig.2 GO biological process enrichment analysis of potential targets

2.3 Hub靶點分析

70個共有差異表達(dá)基因通過STRING進(jìn)行相互作用分析，通過 Cytoscape3.5.1中的cytoHubba中的 epc，degree，mcc，mnc四種算法輸出前10個hub基因(表3)，通過取交集的方法獲取共有6個hub靶點(CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB)。

2.4 化學(xué)成分-靶點-疾病分析

Hub靶點通過CTD篩選參與的關(guān)鍵疾病，通過化學(xué)成分-靶點-疾病分析(表4)，我們發(fā)現(xiàn)趕黃草揮發(fā)油活性成分2-硬脂酸單甘油酯、香葉基丙酮、金合歡基丙酮在肝硬化、肝炎和非酒精性脂肪肝疾病中發(fā)揮重要作用。

表3 Hub基因篩選

2.5 關(guān)鍵活性成分分子對接分析及相互作用分析

大麻素受體1(cannabinoid receptor 1，CNR1)為香葉基丙酮，2-硬脂酸單甘油酯，金合歡基丙酮共有靶標(biāo)蛋白，采用分子對接進(jìn)行驗證，CNR1具有3個原配體(SO4，PEG，7DY)，利用Docking 模塊分別以SO4，PEG，7DY作為模板形成結(jié)合口袋，對接結(jié)果以-log10 為單位模擬結(jié)合能力，配體與受體結(jié)合穩(wěn)定性以Total Score 值的大小來評價，Total Score越大越穩(wěn)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個活性成分與PEG，7DY原配體為模板形成結(jié)合口袋具有較好的結(jié)合，三個活性成分的Total score(TS)>6。

香葉基丙酮，2-硬脂酸單甘油酯，金合歡基丙酮與CNR1(PEG)相互作用有很大的相似性，結(jié)構(gòu)比對顯示Val228，Phe237，Ala236等氨基酸殘基相對位置相同，氨基酸類型相同(表5)。香葉基丙酮，2-硬脂酸單甘油酯，金合歡基丙酮與CNR1(7DY)相互作用有很大的相似性，結(jié)構(gòu)比對顯示Val196，Cys386，Ile105等氨基酸殘基相對位置相同，氨基酸類型相同(表6)。我們可以推測這些殘基就是我們要尋找的CNR1重要殘基。

2.6 關(guān)鍵化學(xué)成分的理化性質(zhì)

將2-硬脂酸單甘油酯、香葉基丙酮、金合歡基丙酮進(jìn)行ADMET性質(zhì)分析。CYP450酶的抑制性：低抑制(low)和高抑制(hight)；根據(jù)Lipinski規(guī)則，小分子應(yīng)該具備氫鍵供體數(shù)≤5，氫鍵受體數(shù)≤10，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)≤10，-2.5≤ Log Po/w(mlogp)≤4.15，MW≤500 g/mol，如果過多參數(shù)不符合，會影響藥物的溶解性及腸吸收能力，2-硬脂酸單甘油酯、香葉基丙酮、金合歡基丙酮基本遵循Lipinski規(guī)則(表7)。

表5 關(guān)鍵活性成分與大麻素受體1(PEG)相互作用分析

表6 關(guān)鍵活性成分與大麻素受體1(7DY)相互作用分析

表7 關(guān)鍵化學(xué)成分理化性質(zhì)

3 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)揭示了趕黃草揮發(fā)油化合物結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，鑒定出31個活性成分，關(guān)鍵活性成分共篩選出70個靶標(biāo)蛋白。6個hub靶點(CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB)，3個主要保肝活性成分：香葉基丙酮，2-硬脂酸單甘油酯，金合歡基丙酮。研究結(jié)果初步篩選出趕黃草揮發(fā)油保肝的關(guān)鍵靶點及活性成分，為趕黃草揮發(fā)油保肝機(jī)理解釋提供理論依據(jù)。

本次研究中發(fā)現(xiàn)趕黃草揮發(fā)油可能通過調(diào)節(jié)大麻素受體2(cannabinoid receptor 2,CNR2)，大麻素受體1(cannabinoid receptor 1,CNR1)，C-C趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)，C-C趨化因子受體3(C-C chemokine receptor type 3,CCR3)，蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PRKCA)，蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ，PRKCB)防治肝硬化、肝炎和非酒精性脂肪肝等肝臟疾病。大麻具有重要的藥用價值，其活性化合物為大麻素，人體體內(nèi)存在兩種大麻素受體[16,17]。大麻素系統(tǒng)紊亂可導(dǎo)致機(jī)體代謝、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等疾病。CNR1是脂質(zhì)類內(nèi)源性大麻素信號系統(tǒng)的主要受體，在腦發(fā)育、脂肪代謝平衡和神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[18,19]。通過相互作用驗證分析發(fā)現(xiàn)香葉基丙酮、2-硬脂酸單甘油酯、金合歡基丙酮與CNR1作用的氨基酸位點有較大的相似性，這些關(guān)鍵的氨基酸位點可能與趕黃草揮發(fā)油的藥效作用密切相關(guān)。

本研究建立了快速篩選揮發(fā)油活性成分藥理作用的方法，能夠快速篩選出藥理作用的關(guān)鍵靶點及活性成分，打破了傳統(tǒng)的揮發(fā)油抗氧化、抗菌等方面的體外研究，為揮發(fā)油藥理作用的評價提供新的思路，為其揮發(fā)油產(chǎn)品開發(fā)提供理論指導(dǎo)。因此，基于分子對接技術(shù)揭示化合物結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，更具準(zhǔn)確性和針對性，可以加快物質(zhì)基礎(chǔ)研究效率，同時能有效闡明有效成分-作用靶點的相關(guān)性，為其中藥多成分、多效應(yīng)的科學(xué)本質(zhì)提供新的研究思路。