張周鑫，侯冠雄，馬亞團(tuán)，黃建萍，羅劍英，楊 靜，顏一軍，黃勝雄*

1云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650091；2中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201；3云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，昆明650500

放線菌(Actinomycetes)是廣泛存在于各種自然生境中的一類(lèi)微生物，種類(lèi)繁多，代謝特征各異[1]。在迄今為止發(fā)現(xiàn)的近萬(wàn)種天然抗生素中，約70%是放線菌合成的。鏈霉菌是放線菌門(mén)中種類(lèi)最多的一個(gè)屬，廣泛分布于土壤、海洋、極端環(huán)境以及一些生物體內(nèi)[2]。鏈霉菌合成的抗生素?cái)?shù)量更是占到了天然抗生素總量的52%[3-6]。烷基間苯二酚是一類(lèi)從植物、海洋生物以及微生物中分離到的具有良好生物活性的天然產(chǎn)物[7-10]，具有DNA解旋[8]、糖蛋白抑制[7]和甘油-3-磷酸脫氫酶抑制等活性[9]。此外，有些烷基間苯二酚還具有一定的抗真菌[11]、細(xì)菌[12]及細(xì)胞毒性[13]。在從微生物中尋找新的活性次生代謝產(chǎn)物的過(guò)程中[14,15]，我們對(duì)一株鏈霉菌Streptomycessp.KIB-H1424發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，得到6個(gè)烷基間苯二酚類(lèi)化合物(化合物1～6)。本文詳細(xì)介紹了6個(gè)化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性。

圖1 化合物1～6的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-6

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker DRX-500、Avance III-400 核磁共振儀(TMS作為內(nèi)標(biāo)，δ為ppm)，Waters Xevo TQ-S超高壓液相三重四級(jí)桿聯(lián)用質(zhì)譜儀；ZQZY-HC恒溫?fù)u床(上海知楚儀器)，日本三菱化學(xué)MCI GEL CHP 20P填料(70～150 μm)，Sephadex LH-20(瑞典AIRTECH生物化學(xué)試劑公司生產(chǎn))，Hitachi Chromaster 5430 高效液相色譜儀器(日立)，YMC-Triart C18型液相色譜柱(250×10 mm I.D.)，中速濾紙(杭州新華紙業(yè)有限公司)，YXQ-LS-18SI 高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?天津市大茂化學(xué)試劑廠，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.2 發(fā)酵菌株

發(fā)酵菌株KIB-H1424分離自云南省玉溪市元江縣采集的蝦子花(Woodfordiafruticosa(L.)Kurz.)根部土壤樣本。菌株經(jīng)過(guò)16S rRNA基因測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)菌株進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與Streptomycestumescensstrain OTP-4-2的基因序列的相似度達(dá)到99.0%。同時(shí)結(jié)合其形態(tài)學(xué)與培養(yǎng)特征，確定其為鏈霉菌屬，命名為Streptomycessp.KIB-H1424?；钚詼y(cè)試菌株金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、斜臥青霉(PenicilliumdecumbensATCC 10436)購(gòu)買(mǎi)自ATCC菌種庫(kù)，小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)由西北農(nóng)林科技大學(xué)馬亞團(tuán)提供。目前發(fā)酵與活性測(cè)試菌株均保存在中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源可持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

固體培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，配方為大豆粉20.0 g/L(煮沸后過(guò)濾取濾液)，甘露醇20.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH=7.0。

種子液培養(yǎng)基：TSB培養(yǎng)基，配方為胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，右旋葡萄糖2.5 g/L，pH=7.3 ± 0.2。

PDA培養(yǎng)基：200.0 g去皮土豆切碎后加入1.0 L自來(lái)水，煮沸30 min，四層紗布過(guò)濾后，濾液加入瓊脂粉20.0 g，右旋葡萄糖20.0 g，定容1.0 L，自然pH。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉 10.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH=7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：M15培養(yǎng)基，配方為右旋葡萄糖30.0 g/L，胰蛋白胨1.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉l5.0 g/L，碳酸鈣2.5 g/L，微量鹽1.0 mL(微量鹽配方：七水合硫酸亞鐵1.0 g，五水硫酸銅0.45 g，七水合硫酸鋅1.0 g，四水硫酸錳0.1 g，鉬酸鉀0.1 g溶于1.0 L蒸餾水中，加鹽酸使溶液澄清)，pH=7.2。

將MS平板上活化好的菌株接種至裝有50 mL種子液的250 mL三角搖瓶中，置于搖床中，28 ℃、200 rpm培養(yǎng)2天。將種子液按5%接種量轉(zhuǎn)接到裝有250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 L三角搖瓶中，置于搖床中，在28 ℃、200 rpm條件下培養(yǎng)7天。

1.4 提取分離

發(fā)酵液以4 000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心20 min。上清液與菌絲體分別用等體積乙酸乙酯萃取3遍。經(jīng)HPLC分析后，合并上清與菌絲體乙酸乙酯萃取物共4.0 g。粗提物經(jīng)MCI依次用甲醇-水(10∶90- 100∶0)梯度洗脫，得到Fr1～Fr9共九個(gè)組分。Fr7組分經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇洗脫)，TLC分析后合并，得到Fr7A～Fr7D四個(gè)組分。Fr7D組分經(jīng)HPLC分離，以80%乙腈等度洗脫得到六個(gè)化合物分別是2(tR=16.8 min,11.7 mg),3(tR=18.2 min,15.0 mg),4(tR=19.2 min,12.9 mg),1(tR=21.1 min,8.7 mg),5(tR=22.0 min,9.4 mg),6(tR=23.0 min,12.3 mg)。

1.5 活性測(cè)試(濾紙片法)

將保存在20%甘油中的指示菌株金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、斜臥青霉(PenicilliumdecumbensATCC 10436)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)分別接種至PDA與LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，分別以28 ℃與37 ℃避光培養(yǎng)4天，待其菌落基本長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基待用。將被測(cè)化合物和多菌靈均配置成濃度2.0 mg/mL的丙酮溶液備用。將活化好的指示菌株分別加入到約40 ℃的PDA與LB培養(yǎng)基中(300 mL培養(yǎng)基中加入一個(gè)培養(yǎng)皿的菌體)并倒入培養(yǎng)皿中(每個(gè)培養(yǎng)皿倒入約25 mL培養(yǎng)基)，待瓊脂凝固后，十字線標(biāo)記。在無(wú)菌濾紙片(直徑5 mm)中心滴加5 μL待測(cè)化合物的丙酮溶液，待丙酮揮發(fā)后將其放置到培養(yǎng)基上。每塊培養(yǎng)基平板均以丙酮作陰性對(duì)照，分別以卡那霉素(2.0 mg/mL)、放線菌酮(2.0 mg/mL)與制霉菌素(2.0 mg/mL)作陽(yáng)性對(duì)照。最后，真菌在28 ℃，細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后觀察抑菌圈大小，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；UV (MeOH)λmax (logε) 203 (2.5),219 (2.0),277 (1.3).IR (KBr)νmax3 355,3 063,2 954,2 920,2 869,2 850,1 598,1 469,1 156 cm-1;。HR-ESI-MS (negative)圖譜給出m/z347.2954[M-H]-(calcd for 347.2956)，結(jié)合13C-NMR確定分子式為C23H40O2。13C-NMR中整個(gè)譜圖明顯的分成低場(chǎng)和高場(chǎng)兩部分。高場(chǎng)部分δC30.7存在大量重疊的碳信號(hào)并且氫譜在δH1.29也存在大量重疊的信號(hào)，推測(cè)有脂肪鏈的存在。低場(chǎng)部分碳譜信號(hào)δC100.9,107.9,146.3,159.3結(jié)合氫譜信號(hào)δH6.08 (1H,t,J=2.2 Hz),6.12 (2H,d,J=2.2 Hz)(見(jiàn)表1)推測(cè)可能存在1,3,5取代的間苯二酚結(jié)構(gòu)單元。結(jié)合HMBC譜中δH6.08的氫與δC159.3,107.9存在HMBC的相關(guān)，同時(shí)δH6.12也存在與δC159.3,107.9,100.9,37.0的HMBC相關(guān)信號(hào)，進(jìn)一步確定了間苯二酚結(jié)構(gòu)單元的存在，并且間苯二酚單元在5位上與δC37.0相連(見(jiàn)圖2)。結(jié)合δH1.22～1.37 (22H,m),1.55 (2H,m)與2.43 (2H,t,J=7.6 Hz)的1H-1H COSY相關(guān)確定脂肪鏈的一端通過(guò)δC37.0與間苯二酚相連。與此同時(shí)δH1.53 (1H,m),1.17 (2H,m)與0.88 (6H,d,J=6.6 Hz)的1H-1H COSY相關(guān)揭示了脂肪鏈的另一端為異丙基單元。綜上，確定化合物1的結(jié)構(gòu)如圖所示(見(jiàn)圖1)?；衔?的核磁及其它相關(guān)詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1 的關(guān)鍵COSY和HMBC相關(guān)信號(hào)Fig.2 The Key COSY and HMBC correlations of compound 1

原子編號(hào)PositionAdipostatin E (1)δCδH(mult,J in Hz)1,3159.3-2100.96.08 (1H,t,J=2.2 Hz)4,6107.96.12 (2H,d,J=2.2 Hz)5146.3-737.02.43 (2H,t, J = 7.6 Hz)832.41.55 (2H,m)930.61.22～1.371030.7～30.81.22～1.371130.7～30.81.22～1.371230.7～30.81.22～1.371330.7～30.81.22～1.371430.7～30.81.22～1.371530.7～30.81.22～1.371630.7～30.81.22～1.371731.01.22～1.371830.31.22～1.371928.51.22～1.372040.31.17 (2H,m)2129.21.53 (1H,m)22,2323.00.88 (6H,d,J=6.6 Hz)Data were measured in methanol-d4

化合物2白色粉末；分子式C21H36O2;ESI-MS:m/z319[M - H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.56 (2H,m,H-8),1.37～1.22 (24H,m,H-9～H-20),0.90 (3H,t,J=6.7 Hz,H-21);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9(C-2),37.0 (C-7),33.1 (C-19),32.4 (C-8),30.8～30.3 (C-9～C-18),23.7 (C-20),14.5 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定為Adipostatin A。

化合物3白色粉末；分子式C21H36O2;ESI-MS:m/z319[M- H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.56 (2H,m,H-8),1.37～1.22 (18H,m,H-9～H-17),0.90 (6H,t,J=6.6 Hz,H-20,H-21);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9 (C-2),40.2 (C-18),37.0 (C-7),32.4 (C-8),30.8～30.4 (C-9～C-16),29.1 (C-19),28.5 (C-17)，23.0 (C-20,C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定為Adipostatin B。

化合物4白色粉末；分子式C22H38O2;ESI-MS:m/z333[M- H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.56 (2H,m,H-8),1.37～1.22 (26H,m,H-9～H-21),0.90 (3H,t,J=6.7 Hz,H-22);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9 (C-2),37.0 (C-7),33.1 (C-20),32.4 (C-8),30.8～30.4 (C-9～C-19),23.7 (C-21),14.5 (C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定為Adipostatin C。

化合物5白色粉末；分子式C22H38O2;ESI-MS:m/z333[M- H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.55 (2H,m,H-8),1.52 (1H,m,H-20),1.37～1.22 (20H,m,H-9～H-18),1.15 (2H,m,H-19),0.86 (6H,m,H-21,H-22);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9 (C-2),40.3 (C-19),37.0 (C-7),32.4 (C-8),31.0 (C-9),30.8～30.7 (C-10～C-15),30.6 (C-16),30.3 (C-17),29.2 (C-20),28.5 (C-18),23.0 (C-21,C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定為Adipostatin D。

化合物6白色粉末；分子式C23H40O2;ESI-MS:m/z347[M- H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.56 (2H,m,H-8),1.37～1.22 (28H,m,H-9～H-22),0.89 (3H,t,J=6.7 Hz,H-23);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9 (C-2),37.0 (C-7),33.1 (C-21),32.5 (C-8),30.8～30.4 (C-9～C-20),23.7 (C-22),14.5 (C-23)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定為5-Heptadecyl-1,3-benzenediol。

2.2 化合物抑菌活性實(shí)驗(yàn)

以6株指示菌金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、斜臥青霉(PenicilliumdecumbensATCC 10436)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)為指示菌株檢測(cè)6個(gè)化合物的抗菌活性。結(jié)果顯示6個(gè)化合物對(duì)所選的6株指示菌均無(wú)明顯抑制活性。

3 討論

本研究從鏈霉菌Streptomycessp.KIB-H1424 的發(fā)酵液中分離得到了6個(gè)間苯二酚類(lèi)化合物——1個(gè)新的烷基間苯二酚類(lèi)化合物1和5個(gè)已知的化合物(化合物2～6)。化合物2和3第一次被發(fā)現(xiàn)是作為甘油-3-磷酸脫氫酶抑制劑在鏈霉菌S.cyaneus2299-SV1中被分離得到[9]。后來(lái)，Mostafa等[16]對(duì)化合物2～5的研究又發(fā)現(xiàn)了其對(duì)成年馬來(lái)絲蟲(chóng)(Brugiamalayi)的殺滅活性。本研究中的6個(gè)間苯二酚化合物對(duì)所選的6株指示菌雖沒(méi)有明顯的抗菌活性，但豐富了間苯二酚類(lèi)化合物的種類(lèi)，為鏈霉菌來(lái)源化合物的藥物開(kāi)發(fā)利用提供了一定的化學(xué)基礎(chǔ)，為醫(yī)藥及天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。