陳世鉆，俞富祥，陳俊予，唐銀河

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015）

我國是慢性肝病大國，更是肝惡性腫瘤的高發(fā)國家。嚴(yán)重慢性肝病和肝惡性腫瘤的晚期需要肝臟移植治療[1]。肝移植治療對(duì)肝臟供體的巨大需求與肝臟供體的嚴(yán)重短缺形成了巨大反差[2]，因此，肝臟再生的研究刻不容緩。肝臟再生一直是肝臟疾病研究中的重要環(huán)節(jié)，但經(jīng)過多年的探索對(duì)其機(jī)制仍是知之甚少，一個(gè)重要的原因是缺乏一個(gè)簡單方便的可重復(fù)的肝再生動(dòng)物模型。2014年JIANG等[3]利用整個(gè)肝臟組織去細(xì)胞制備成去細(xì)胞支架。此后又有多個(gè)研究小組報(bào)道運(yùn)用各種去細(xì)胞方式制備去細(xì)胞支架[4]，但目前仍未有簡單可重復(fù)的肝臟再生模型。本研究旨在探究新型大鼠肝臟再生模型，為肝臟再生及肝臟移植的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)液購自美國Sigma公司，胰蛋白酶消化液、Triton X-100、Percoll分離液、IV膠原酶、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）一抗、ET-1二抗、DAPI染液、肝細(xì)胞細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK-18）一抗、CK-18二抗、DAB顯色試劑盒購自北京Solarbio公司，倒置熒光顯微鏡購自廣州明美光電有限公司，密度梯度離心機(jī)購自長沙英泰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肝細(xì)胞分離：取SD大鼠，用75%乙醇浸泡消毒5 min后，在無菌條件下取出肝臟，剪碎，并用Hanks液反復(fù)清洗3次后，用0.1%的IV型膠原酶消化30 min，此后用3倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，最后將組織懸液經(jīng)100目鋼網(wǎng)過濾，然后反復(fù)洗滌殘?jiān)占癁V液。濾液用50×g離心2 min，上清富含非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，而沉淀則富含肝細(xì)胞。收集沉淀，用DMEM+20% FBS+雙抗培養(yǎng)基將細(xì)胞進(jìn)行重懸鋪板后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分離：將上述上清液進(jìn)行100×g離心5 min，再次收集上清，用350×g離心10 min，取得沉淀后經(jīng)洗滌后混懸于20 mL PBS中。在50 mL離心管內(nèi)，每10 mL細(xì)胞懸液平鋪在二層Percoll梯度的上層（底層是15 mL 50% Percoll，中間層是20 mL 25% Percoll），這樣在50 mL離心管內(nèi)從下至上形成50% Percoll、25% Percoll和細(xì)胞懸液3層梯度。用900×g離心20 min，吸取中間帶混懸液約10 mL（在50% Percoll與25% Percoll之間），予PBS等量稀釋后再經(jīng)900×g離心10 min，保留沉淀。加入DMEM/F12+20% FBS+雙抗培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸形成肝竇內(nèi)皮細(xì)胞懸液鋪板后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 免疫熒光法檢測(cè)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面ET-1的表達(dá)：分離出的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定，加入5% BSA液封閉后，加入一抗ET-1（1:200），37 ℃孵育3 h后，加入Cy3（1:200）免疫熒光二抗，并隨后用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3.4 細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色：分離出的肝細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定，用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透20 min；在培養(yǎng)皿加入新鮮配制的3%雙氧水，去除內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，然后滴加足夠量的稀釋好的一抗：CK-18（1:600），此后滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗工作液，DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，經(jīng)脫水、透明、封片后鏡檢。

1.3.5 肝細(xì)胞支架制備：選取正常狀態(tài)良好的SD大鼠取肝臟，注意保護(hù)好肝臟的完整性；用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗，高濃度雙抗液體（滅菌用水配制，青霉素及鏈霉素濃度分別為4 000 U/mL）浸潤消毒10 min；從SD大鼠肝臟門靜脈處插管，用PBS循環(huán)灌注肝臟標(biāo)本2 h以沖出殘留血液；之后用0.02%胰酶循環(huán)灌注2 h以消化肝臟組織；隨后用Triton X-100循環(huán)灌注15 h清除殘余的肝組織；最后依次用0.1%過氧乙酸灌洗消毒1 h，滅菌PBS灌洗1 h，制備成去細(xì)胞支架。之后行HE染色檢查和掃描電鏡檢查鑒定肝細(xì)胞支架。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量形態(tài) 每個(gè)肝臟標(biāo)本能成功分離出1×107個(gè)肝細(xì)胞，低倍鏡下可見活細(xì)胞呈圓形，飽滿，胞核清晰。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增至1×106，大部分細(xì)胞光鏡下為小圓形，大小均勻，2 h后開始貼壁，出現(xiàn)三角形或不規(guī)則形，隨著時(shí)間延長，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)逐漸呈梭形，細(xì)胞邊緣清楚，細(xì)胞核突起位于中央。

2.2 肝細(xì)胞免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 肝細(xì)胞進(jìn)行CK-18免疫組織化學(xué)鑒定，200倍顯微鏡下可見肝細(xì)胞胞漿內(nèi)存在棕黃色顆粒，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色（見圖1）。

2.3 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞熒光單染實(shí)驗(yàn) 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)ET-l多抗間接免疫熒光法鑒定，90%的細(xì)胞熒光染色陽性；因此培養(yǎng)48 h的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞純度可達(dá)90%左右。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后在倒置免疫熒光顯微鏡下呈藍(lán)色，見圖2。

圖1 肝細(xì)胞CK-18免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖2 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果

圖3 排盡血液前后大鼠肝臟組織大體觀

2.4 肝細(xì)胞支架制備及鑒定 SD大鼠肝組織標(biāo)本呈暗紅色（見圖3A），經(jīng)PBS灌注排盡血液后呈蠟黃色（見圖3B），此后經(jīng)0.02%胰酶灌注消化、3% Triton X-100循環(huán)灌注后，殘留血液逐漸被沖凈，細(xì)胞成分逐漸被脫除，大鼠肝臟標(biāo)本逐漸趨于透明膠凍樣（見圖4A-B）。制備的大鼠肝臟去細(xì)胞基質(zhì)呈無色透明，表面平整，肝臟包膜完整（見圖4C）。HE染色顯示肝臟去細(xì)胞支架呈蜂窩樣孔隙結(jié)構(gòu)，纖維樣細(xì)胞外基質(zhì)保留，未見細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)成分殘留（見圖5）。掃描電鏡證實(shí)肝組織去細(xì)胞支架內(nèi)僅存留多孔隙樣細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，孔隙內(nèi)原有占位的細(xì)胞成分被完全脫除，視野內(nèi)尚可見較為完整的血管斷面、中央靜脈結(jié)構(gòu)和門管三聯(lián)結(jié)構(gòu)（見圖6）。

3 討論

近年來，隨著終末期慢性肝病患者及肝惡性腫瘤患者數(shù)量日益增多，肝移植技術(shù)的運(yùn)用愈發(fā)廣泛，而短缺的肝臟供體問題愈發(fā)突出[5]。為解決肝源緊缺問題，“人造肝”成為近年來的研究熱點(diǎn)。其中天然的組織器官去細(xì)胞支架制備而成的“人造肝”具有完整脈管系統(tǒng)和天然的細(xì)胞外基質(zhì)[6]，并且能夠高度模擬細(xì)胞自然生長的微環(huán)境，為細(xì)胞生長提供氧氣和養(yǎng)分，可以保證定植細(xì)胞發(fā)揮效能。肝臟去細(xì)胞基質(zhì)從生理、生化和幾何角度等方面都更接近肝臟細(xì)胞自然生長環(huán)境[7]，提高肝臟細(xì)胞重新植入肝細(xì)胞支架后存活的成功率。本研究利用SD大鼠的肝臟標(biāo)本經(jīng)Triton X-100循環(huán)灌注成功制備了符合標(biāo)準(zhǔn)的肝組織去細(xì)胞支架，未見明顯細(xì)胞核，并保留了完整的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。掃描電鏡檢查證實(shí)在有效去除細(xì)胞的同時(shí)，保留原有肝臟的細(xì)胞外基質(zhì)的組成和脈管結(jié)構(gòu)。并且制備成的支架具有良好的孔徑和孔隙率，這有利于受體細(xì)胞的浸潤和植入，有利于后續(xù)肝細(xì)胞植入、再生方面實(shí)驗(yàn)研究的開展[8]。

圖4 肝細(xì)胞灌注過程

圖5 正常肝臟組織和肝臟去細(xì)胞支架HE染色結(jié)果（×100）

圖6 正常肝臟組織和肝臟去細(xì)胞支架掃描電鏡觀查結(jié)果

肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝臟病理生理及器官移植中的作用已引起人們重視[8]，獲得高純度和活力的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞是進(jìn)行細(xì)胞重新植入去細(xì)胞支架再生形成“人工肝”的基礎(chǔ)[9]。本研究在分離培養(yǎng)的過程中，多次調(diào)整分離原代肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞方法[10]，總結(jié)出一套較為穩(wěn)定且分離純度較高的肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的分離方法[11]。通過摸索與實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，大鼠肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的成功分離與以下因素密切相關(guān)：①選擇合適的膠原酶消化肝組織。膠原酶IV主要針對(duì)肝臟組織中的膠原成分及纖維組織有消化分解作用，而對(duì)上皮細(xì)胞的影響不大。可以利用此特性分離提純肝細(xì)胞[12]。②消化酶的濃度一般以0.1%～0.15%為宜，消化酶的濃度過高會(huì)破壞肝細(xì)胞膜，濃度過低則會(huì)使對(duì)肝臟消化不徹底，均會(huì)使分離下來的肝細(xì)胞成活率低。③采用低速離心（50×g）分離法既可將肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離開，又可減少對(duì)肝臟細(xì)胞的損害[13]，提高分離出的肝臟細(xì)胞的存活率。④選擇含有多種因子的培養(yǎng)液，并且加入足夠的血清及營養(yǎng)[14]，保證實(shí)驗(yàn)期間肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定及較高的存活率。⑤在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的過程中，分離出的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞純度主要取決于Percoll密度梯度離心是否徹底。選擇合適的離心機(jī)及合適的離心轉(zhuǎn)數(shù)顯得尤為重要[15]。⑥梯度離心時(shí)可以將離心機(jī)調(diào)節(jié)為慢剎車狀態(tài)，這樣更有助于形成梯度離心后的懸浮細(xì)胞層。

總之，本研究成功分離出了肝細(xì)胞以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，并成功制備了肝臟去細(xì)胞支架，為下一步的肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的植入及肝再生鑒定了基礎(chǔ)。希望給后續(xù)以臨床為導(dǎo)向的肝臟組織工程研究提供參考。