陸素文，胡碧波，鄧輝

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙周科，浙江 溫州 325027）

牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLCs）作為牙周膜的主要細(xì)胞，在張應(yīng)力作用下可骨向分化，是牙槽骨改建的重要效應(yīng)細(xì)胞[1-2]。然而，PDLCs如何感知力學(xué)信號并轉(zhuǎn)化為生化信號，亟待闡明。核心結(jié)合因子α1（core binding factor α1，Cbfα1）是重要的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子之一[3]，含有RUNT結(jié)構(gòu)域，與DNA上的OSE2序列結(jié)合后，啟動骨鈣素（osteocalcin，OCN）、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）、I型膠原（collagen type I，COL I）等成骨特異性基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進骨向分化[4]，在骨形成中發(fā)揮重要作用[5]。目前對于Cbfα1活化的上游機制還知之甚少。

TAZ（PDZ binding transcriptional activator of transcription）即PDZ結(jié)合基序轉(zhuǎn)錄共激活因子，是Hippo信號通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，在感知及介導(dǎo)機械信號過程中扮演重要角色。未發(fā)生磷酸化的TAZ進入細(xì)胞核后結(jié)合含有Pro-Pro-X-Tyr保守序列的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性[6]。研究已證實TAZ是Cbfα1的轉(zhuǎn)錄共激活因子，且與骨向分化調(diào)控有關(guān)[7-8]。新近關(guān)于TAZ作為細(xì)胞外機械信號傳感器參與細(xì)胞分化的研究已成為研究熱點。然而TAZ是否通過調(diào)控Cbfα1從而參與應(yīng)力所促進的PDLCs的骨向分化，目前未見報道。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），二甲基亞砜、地塞米松、甘油磷酸鈉、抗壞血酸（美國Sigma公司），引物（上海捷瑞生物工程有 限公司），TRIzol Reagent（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司），TAZ、Cbfα1、COL I抗體（美國Santa Cruz公司），OSX抗體（英國Abcam公司），OCN抗體（美國Milipore公司），GAPDH抗體（上?？党缮锕こ逃邢薰荆ㄐ蔚鞍?、角形蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司），BCA蛋白濃度試劑盒、Lipofectamine 6 000（上海碧云天公司）。

1.1.2 主要儀器：低溫高速離心機（美國Beckman公司），PCR擴增儀、凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司），Lightcycler480熒光定量PCR儀（美國Roche公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）的原代培養(yǎng)和鑒定：本研究的原代hPDLCs來自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診患者拔除的第三磨牙?；颊吣挲g為18～30歲，全身無系統(tǒng)性疾病史，無家族遺傳性疾病史，口腔衛(wèi)生良好，無吸煙史。收集無牙體缺損、無齲壞，無炎癥的第三磨牙。本研究通過本院倫理學(xué)審查，所有患者均簽署知情同意書。PBS反復(fù)沖洗，刮取根中1/3 部分的牙周膜組織，用剪刀修剪成約1 mm3，0.3% I型膠原酶100 μL消化，離心，棄上清，PBS吹打，棄上清。加入1 mL完全培養(yǎng)基（含10% FBS），37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后補液至3 mL，每3 d換液。采用抗角蛋白和抗波形蛋白染色鑒定細(xì)胞來源。

1.2.2 張應(yīng)力加載：取3～5代hPDLCs以2×105個/mL密度接種到BioFlex加力板中。待細(xì)胞長至80%，置于Flexcell 5 000 T裝置，12%形變率，頻率0.5 Hz，加力時間分別為24 h和48 h。

1.2.3 實時熒光定量PCR：依據(jù)TRIzol Reagent試劑盒說明，采用酚-氯仿提取法提取總RNA，取部分用于純度測定。NanoDrop 2 000超微量分光光度計測定總RNA的濃度以及純度（OD260nm/OD280nm），若兩者比值介于1.8～2.0之間，則可認(rèn)為純度合格。依據(jù)PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒說明書，取20 μL反應(yīng)體系，用于總量為1 000 ng的總RNA的反轉(zhuǎn)錄過程。依據(jù)實時熒光定量PCR SYBR Green染料法的要求，設(shè)計引物（見表1）。按照試劑盒要求，采用ABI StepOne Plus熒光定量PCR儀擴增cDNA模板。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達水平。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot檢測：將RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑PMSF按照100:1的比例振蕩混合；每孔均勻加入100 μL配置好的細(xì)胞裂解液，充分裂解20 min，輕柔刮取細(xì)胞裂解物；4 ℃，離心，取上清。BCA試劑盒測定蛋白濃度，將各組樣本總蛋白調(diào)至相同，并在EP管中按樣本量：5×loading buffer=4:1的比例加入loading buffer，ddH2O補足至20 μL上樣體積；將配制好的樣本置于100 ℃煮沸。配置8%分離膠和5%濃縮膠，上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，孵育一抗[兔屬抗人TAZ抗體1:500，兔屬抗人Cbfα1抗體1:1 000，兔屬抗人OSX抗體1:1 000，山羊?qū)倏谷薈OL I抗體1:10 000，小鼠屬抗人OCN抗體1:1 000，內(nèi)參蛋白（兔屬抗人抗體β-actin 1:2 000）]，孵育二抗（山羊抗兔二抗1:4 000，兔抗山羊二抗1:8 000，山羊抗小鼠二抗1:8 000）。均勻滴加發(fā)光液孵育后曝光。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）：新鮮配制含1 mmol/L PMSF Western blot及IP細(xì)胞裂解液，每孔中加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液100 μL，4 ℃裂解20 min，刮取裂解產(chǎn)物。4 ℃離心，取上清，取部分樣本用作Input樣本；BCA法測定蛋白濃度；根據(jù)蛋白濃度，取出含300～400 μg蛋白的上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，每管總蛋白中加入0.5～1.0 μg TAZ抗體，緩慢搖晃過夜后，每管加入20 μL Protein A+G agarose，4 ℃離心去上清，收集的瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物以60 μL 1×上樣緩沖液重懸；將上樣樣品煮5 min，離心取上清行Western blot。

1.2.6 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）：在轉(zhuǎn)染前1 d按照以細(xì)胞2×105個/mL接種到孔板內(nèi)；轉(zhuǎn)染前把孔板每孔換成2 mL新鮮DMEM（不含血清及抗生素）；取2個無菌EP管，每管加入125 μL不含抗生素和血清的高糖DMEM培養(yǎng)基；一管加入100 pmol TAZ siRNA，輕輕吹打混勻，另一管加入5 μL Lipo 6 000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻；2管室溫靜置5 min，將含有Lipo 6 000轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液用移液槍加入含TAZ siRNA的培養(yǎng)液中，吹打混勻；將250 μL Lipo 6 000 siRNA混合物均勻滴加到整個孔內(nèi)，隨后輕輕混勻；細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)5 h后更換新鮮培養(yǎng)液；繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，Western blot檢測TAZ的表達量，篩選合適的siRNA；對于合適的siRNA，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)3 d對細(xì)胞加載張應(yīng)力，收集細(xì)胞樣本。所選用的siRNA序列為：TAZ siRNA：5’-CCCUAGG AAGGCGAUGAAUTT-3’，5’-AUUCAUCGCCUUCCUAGGGTT-3’；CON siRNA：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，5’-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLCs的原代培養(yǎng)與鑒定 原代培養(yǎng)hPDLCs 7 d后，組織塊周圍有細(xì)胞呈放射狀爬出，呈長梭型，胞漿飽滿、均勻。14 d后，細(xì)胞繼續(xù)生長，排列緊密，形態(tài)良好。傳代后細(xì)胞無規(guī)則散在分布。免疫細(xì)胞化學(xué)染色示細(xì)胞波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。這證實該細(xì)胞為中胚層來源，即該細(xì)胞為hPDLCs。

2.2 張應(yīng)力對hPDLCs骨向分化指標(biāo)及TAZ表達的影響 應(yīng)用Flexcell 5 000 T細(xì)胞應(yīng)力加載儀對hPDLCs施加張應(yīng)力（0.5 Hz，12%），分為對照組、張應(yīng)力加載24 h組、張應(yīng)力加載48 h組。隨著張應(yīng)力加載時間的增加，細(xì)胞成骨指標(biāo)上調(diào)。實時熒光定量PCR結(jié)果示：COL I、OSX mRNA相對表達量隨著張應(yīng)力加載時間增加呈現(xiàn)明顯上升；Cbfα1、OCN的相對表達量在24 h時未呈現(xiàn)明顯變化，應(yīng)力加載48 h時則呈現(xiàn)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。Western blot結(jié)果示：隨著張應(yīng)力加載時間的增加，Cbfα1、COL I、OCN、OSX蛋白相對表達量明顯上升，而OCN的最高值出現(xiàn)在24 h，48 h時表達略有下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 張應(yīng)力對hPDLCs骨向分化的影響

2.3 張應(yīng)力對TAZ表達及與Cbfα1結(jié)合的影響 選擇24 h作為后續(xù)研究的應(yīng)力加載時間。張應(yīng)力加載能上調(diào)TAZ mRNA和蛋白水平的表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A-B。Co-IP檢測TAZ與Cbfα1的結(jié)合狀況，結(jié)果示：加載張應(yīng)力后，在全細(xì)胞裂解樣本中TAZ與Cbfα1蛋白表達均上升；應(yīng)用TAZ抗體沉淀樣本中的細(xì)胞內(nèi)源性TAZ，比較相同TAZ量所結(jié)合的Cbfα1量發(fā)現(xiàn)，張應(yīng)力組中TAZ所結(jié)合的Cbfα1蛋白量顯著高于對照組（見圖2C）。

2.4 TAZ沉默對hPDLCs骨向分化的影響 hPDLCs轉(zhuǎn)染Con siRNA及TAZ siRNA 72 h后，以12%，0.5 Hz張應(yīng)力作用細(xì)胞24 h，Western blot檢測蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染Con siRNA的細(xì)胞在張應(yīng)力加載后，COL I、Cbfα1、OCN的蛋白表達水平明顯上升，與前述結(jié)果一致；轉(zhuǎn)染TAZ siRNA的細(xì)胞，TAZ的蛋白表達水平明顯下降，TAZ沉默有效。除OSX表達下降外，COL I、Cbfα1、OCN無明顯變化；轉(zhuǎn)染TAZ siRNA可顯著下調(diào)張應(yīng)力促進的骨向分化蛋白表達（見圖3）。

圖2 張應(yīng)力對TAZ表達及與Cbfα1結(jié)合的影響

圖3 TAZ沉默對張應(yīng)力作用下TAZ及骨向分化蛋白表達的影響

3 討論

Cbfα1在應(yīng)力調(diào)控PDLCs骨向分化中發(fā)揮核心作用。研究發(fā)現(xiàn)Cbfα1基因敲除小鼠的骨骼形態(tài)正常，但無成骨細(xì)胞及成骨前體細(xì)胞，多種細(xì)胞外基質(zhì)表達消失或減弱[9]。ZIROS等[10]研究發(fā)現(xiàn)，機械應(yīng)力上調(diào)hPDLCs表達Cbfα1，同時與DNA的結(jié)合力也顯著增強。宋京等[11]進一步發(fā)現(xiàn)張應(yīng)力通過激活ERK1/2信號通路后上調(diào)Cbfα1的表達。Cbfα1在應(yīng)力調(diào)控骨向分化中的上游機制尚未完全闡明。

多項TAZ的研究為闡明張應(yīng)力調(diào)控Cbfα1轉(zhuǎn)錄活性從而參與骨向分化的機制提供了新途徑。TAZ的分子結(jié)構(gòu)有WW結(jié)構(gòu)域，可與含有Pro-Pro-X-Tyr保守序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，如Cbfα1等，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮共激活作用；而磷酸化TAZ則與14-3-3結(jié)合蛋白連接，位于細(xì)胞質(zhì)處于失活狀態(tài)[6]。酵母雙雜交實驗最初發(fā)現(xiàn)：TAZ是Cbfα1 的轉(zhuǎn)錄共激活因子，與骨向分化密切相關(guān)[7]；YANG等[12]證實TAZ轉(zhuǎn)基因小鼠高表達Cbfα1和轉(zhuǎn)化生長因子β，其顱骨細(xì)胞成骨蛋白表達及骨密度和骨小梁體積均增加；ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)TAZ慢病毒轉(zhuǎn)染去勢大鼠，可上調(diào)Cbfα1的表達，骨質(zhì)疏松表型受抑制。此外，多囊蛋白1[14]、淫羊藿苷[15]等通過激活TAZ促進細(xì)胞的骨向分化。TAZ定位劑TM-25659，可提高TAZ核轉(zhuǎn)移量，上調(diào)Cbfα1表達，促進成骨細(xì)胞分化。敲除TAZ基因后，成脂分化能力明顯增強。此外TM-25659可明顯緩解雌激素缺乏引起的骨量丟失[16]。以上均提示，TAZ通過調(diào)控Cbfα1在細(xì)胞骨向分化中發(fā)揮重要作用。

此后，DUPONT等[17]在Nature發(fā)文首次報道細(xì)胞外基質(zhì)硬度、幾何形態(tài)及細(xì)胞與基質(zhì)間的黏著性等機械信號通過調(diào)控TAZ的表達以及核定位影響細(xì)胞增殖分化。據(jù)此推測，TAZ在細(xì)胞感知和響應(yīng)力學(xué)信號中也可能發(fā)揮重要作用。對此本研究進行了深入探討，利用國際公認(rèn)的美國Flexcell系統(tǒng)構(gòu)建張應(yīng)力加載模型，探索TAZ在張應(yīng)力調(diào)控hPDLCs骨架變化促進其骨向分化中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加載12%，0.5 Hz張應(yīng)力24 h及48 h時顯著促進hPDLCs的TAZ、Cbfα1、COL I、OSX、OCN表達 水平；后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)，張應(yīng)力作用hPDLCs，24 h時TAZ水平升高，入核增加，與Cbfα1的結(jié)合量相應(yīng)增加；hPDLCs轉(zhuǎn)染TAZ siRNA 72 h，加載12%，0.5 Hz張應(yīng)力24 h，TAZ蛋白水平及張應(yīng)力所促進的細(xì)胞成骨蛋白表達下降。初步證實TAZ通過調(diào)控Cbfα1表達和轉(zhuǎn)錄活性影響骨向分化功能，在張應(yīng)力促進hPDLCs骨向分化中發(fā)揮調(diào)控作用。對于TAZ如何調(diào)控Cbfα1的表達，相關(guān)信號通路如何，還需今后進一步研究。