陳君第霞，潘曉瓊，禹博威，胡臻

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325027）

糖尿病是一類由糖代謝紊亂而引起的以長(zhǎng)期高血糖為主要特征的代謝性疾病，可導(dǎo)致多種并發(fā)癥，包括糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）、視網(wǎng)膜病變、心血管疾病及神經(jīng)損傷等[1-2]。隨著社會(huì)的發(fā)展、人口老齡化以及生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病人數(shù)呈迅猛增長(zhǎng)的趨勢(shì)，已經(jīng)成為21世紀(jì)人類健康的最大威脅之一。DN是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎臟病的主要原因之一[3]。蛋白尿、高血壓、腎小球?yàn)V過(guò)率降低是DN的主要臨床表現(xiàn)[4]。大量研究表明炎癥與DN的病理發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。因此，有效改善糖尿病炎癥狀態(tài)成為防治DN的重要措施之一。

梔子苷，也稱梔子甙（geniposide），是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是梔子中主要活性成分[7]。近年，越來(lái)越多的臨床、動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明梔子苷具有抗炎[8]、抗氧化[9]、降低血糖[10]、神經(jīng)保護(hù)[11]、保肝利膽[12]等多種生物學(xué)活性，并引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。研究表明，梔子苷可以通過(guò)激活Nrf2 信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）蛋白表達(dá)[13]。梔子苷能有效降低脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中炎癥狀態(tài)下TNF-α和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等的表達(dá)和釋放[14]。目前梔子苷緩解DN炎癥狀態(tài)的研究較少，本研究擬利用鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）建立1型糖尿病小鼠模型，觀察梔子苷對(duì)改善DN損傷的作用效果，為DN提供新的治療方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：32只SPF級(jí)C57BL/6J小鼠雄性（6～8周齡），體質(zhì)量18～22 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)物動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2015-0001。

1.1.2 主要試劑：梔子苷（純度＞98%）購(gòu)自上海莫奇生物科技有限公司，STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，血糖儀及血糖試紙購(gòu)自瑞士羅氏公司，TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Inritrogen公司，TNF-α、IL-6、IL-1β和β-actin引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，HE染色試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要設(shè)備：熒光正置顯微鏡（日本Nikon公司），HM340E半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），TPJ-A型攤片機(jī)、TPJ-A型烘片機(jī)（常州中威電子儀器有限公司），艾本德高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），T100型梯度PCR儀、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病動(dòng)物模型的建立：SPF 級(jí)雄性C57BL/6J小鼠36只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取28 只小鼠作為造模小鼠，剩余8 只小鼠作為正常組。0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH為4.5）溶解STZ，配制成1%的STZ（配置過(guò)程冰浴避光，現(xiàn)配現(xiàn)用）。造模前小鼠禁食不禁水12 h，造模小鼠以每天50 mg/kg STZ進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)5 d，正常組小鼠以等量0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行腹腔注射。注射藥物后每7 d在小鼠尾靜脈取血，用快速血糖儀測(cè)小鼠空腹6 h后血糖，連續(xù)2次≥13.9 mmol/L者為造模成功小鼠[15]。

1.2.2 分組和給藥：28只造模的小鼠中，有24只造模成功，將其隨機(jī)分為模型組、梔子苷低劑量組（100 mg/kg）和梔子苷高劑量組（200 mg/kg），每組8只。梔子苷處理組以不同劑量梔子苷，模型組和正常組均以等量0.9%氯化鈉溶液每天灌胃，連續(xù)給藥8周。

1.2.3 一般情況記錄以及血糖、體質(zhì)量的測(cè)量：實(shí)驗(yàn)期間觀察并記錄各組小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)反應(yīng)、毛色情況、飲食飲水量、墊料潮濕情況以及大便情況，每2周測(cè)量并記錄小鼠血糖和體質(zhì)量。

1.2.4 標(biāo)本采集：給藥8周后，采用10%水合氯醛麻醉小鼠，切開(kāi)腹腔迅速摘取腎組織，分裝標(biāo)本，部分于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，部分?%中性甲醛溶液中固定備用。

1.2.5 腎臟組織形態(tài)學(xué)檢查：腎臟組織置于4%中性甲醛溶液中24 h后，流水沖洗過(guò)夜，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，按照HE染色試劑說(shuō)明書(shū)操作，光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化，重點(diǎn)觀察腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.6 RT-qPCR法檢測(cè)小鼠腎臟組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達(dá)：用TRIzol法提取腎臟組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟，以RNA為模板合成cDNA。參照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析腎臟組織內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的含量。所用小鼠基因的引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RT-qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠生存狀態(tài)記錄 給藥期間正常組小鼠生活狀態(tài)良好；模型組小鼠出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)減少，毛色欠光澤，易脫落，多食、多飲、多尿癥狀，墊料潮濕，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢等現(xiàn)象；隨著實(shí)驗(yàn)灌胃給藥的進(jìn)行，梔子苷低、高劑量組小鼠上述癥狀較模型組有所改善。

2.2 梔子苷對(duì)4組小鼠體質(zhì)量的影響 正常組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，梔子苷低、高劑量組和模型組的體質(zhì)量明顯低于正常組（P＜0.01）。隨著梔子苷的干預(yù)治療，給藥8周后，梔子苷低劑量組和模型組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），梔子苷高劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組明顯增多（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 梔子苷對(duì)4組小鼠體質(zhì)量的影響（每組n=8）

2.3 4組小鼠空腹血糖比較 正常組小鼠空腹血糖波動(dòng)穩(wěn)定，梔子苷低、高劑量組和模型組空腹血糖明顯高于正常組（P＜0.01）。隨著梔子苷的干預(yù)治療，給藥8周后，模型組空腹血糖仍維持在較高的水平，梔子苷低劑量和高劑量組小鼠的空腹血糖水平降低，高劑量組小鼠空腹血糖較模型組明顯下降（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 梔子苷對(duì)4組小鼠空腹血糖的影響（每組n=8）

2.4 4組小鼠腎臟組織形態(tài)比較 梔子苷干預(yù)治療8周后，正常組小鼠腎小球形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管袢完整，球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)量正常，腎小管形態(tài)良好，間質(zhì)未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠腎小球毛細(xì)血管袢受損形變，系膜細(xì)胞減少，小葉分隔增寬，呈分葉狀，腎小管上皮細(xì)胞萎縮、壞死、管腔變大，腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。梔子苷低劑量和高劑量組小鼠腎組織病理?yè)p傷有很大程度上緩解，血管球形態(tài)有一定恢復(fù)，系膜細(xì)胞增多，腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞明顯減少，見(jiàn)圖3。

2.5 4組小鼠腎臟組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 梔子苷干預(yù)治療8周后，與模型組相比較，梔子苷低劑量和高劑量組腎組織中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

3 討論

梔子作為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛等作用。傳統(tǒng)臨床中常用于治療熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍等病變，近幾十年逐漸將其運(yùn)用到糖尿病及其并發(fā)癥的治療中。從梔子果實(shí)中提取的的環(huán)烯醚萜類化合物梔子苷具多種生物學(xué)活性。梔子苷能夠保護(hù)糖尿病小鼠胰島結(jié)構(gòu)，促進(jìn)β細(xì)胞增殖，增加胰島素分泌，從而降低血糖[16]。梔子苷可以降低膿毒血癥小鼠血清促炎因子表達(dá)水平，緩解多器官功能障礙狀態(tài)[8]。本研究探討梔子苷能否改善STZ誘導(dǎo)的DN小鼠炎癥狀態(tài)，從而保護(hù)腎組織。糖尿病小鼠連續(xù)灌胃8 周，每日1次，梔子苷低劑量組和梔子苷高劑量組能有效增加小鼠體質(zhì)量，降低血糖，且呈劑量依賴性。但梔子苷低劑量組和梔子苷高劑量組血糖值仍舊遠(yuǎn)高于正常組，這可能與梔子苷劑量不足有關(guān)。給藥8周后，梔子苷低劑量組和梔子苷高劑量組小鼠腎組織血管球形態(tài)有一定恢復(fù)，系膜細(xì)胞增多，腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，說(shuō)明梔子苷能有效緩解小鼠腎組織病理?yè)p傷，改善小鼠的DN狀態(tài)。

圖3 4組小鼠腎組織病理切片HE染色結(jié)果（×200）

圖4 4組小鼠腎組織中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的相對(duì)表達(dá)量（每組n=8）

越來(lái)越多的證據(jù)表明，持續(xù)低度炎癥反應(yīng)狀態(tài)對(duì)DN的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程具有重要影響[17]。TNF-α、IL-6 和IL-1β是重要的促炎因子，這些因子的過(guò)度分泌促進(jìn)了中性粒細(xì)胞聚集和激活，進(jìn)而向炎癥部位遷移、吞噬細(xì)胞、釋放卵清蛋白酶、產(chǎn)生活性氧和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，促進(jìn)糖尿病相關(guān)炎癥進(jìn)展，導(dǎo)致糖尿病患者的免疫紊亂[18-19]。本研究結(jié)果顯示，梔子苷干預(yù)治療8周后，與模型組相比較，梔子苷低劑量和高劑量組TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)顯著下降，且呈劑量依賴性。說(shuō)明梔子苷可以降低DN小鼠炎癥相關(guān)RNA表達(dá)，減弱炎癥狀態(tài)，為進(jìn)一步炎癥分子機(jī)制研究提供依據(jù)。

綜上所述，梔子苷能有效改善小鼠的DN狀態(tài)，降低血糖，保護(hù)腎組織，其調(diào)控機(jī)制可能與其能改善糖尿病小鼠炎癥狀態(tài)有關(guān)，但具體炎癥分子機(jī)制有待研究。