鄒瑜馳，陳珺，黃文婷，劉歡，胡健，劉斐，王冬雪，朱麗云，林麗

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 老年醫(yī)學科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江溫州 325035）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。PD的病理改變是腦部黑質(zhì)致密部紋狀體多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元發(fā)生進行性變性，造成黑質(zhì)紋狀體內(nèi)DA及相似酶系統(tǒng)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）明顯減少。研究報道姜黃素具有神經(jīng)保護作用[2]，姜黃素類似物L6H3[（E）-3-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1-（4-甲氧基苯基）丙-2-烯-1-酮]去除了姜黃素結(jié)構(gòu)中的不穩(wěn)定的β-二酮基團，具有更好穩(wěn)定性的同時也能發(fā)揮與姜黃素相似的神經(jīng)保護作用[3]，而L6H3對PD及其腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響鮮見報道。本研究探討姜黃素類似物L6H3對PD大鼠腦部紋狀體細胞外液中7種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：35只SPF級雄性SD大鼠（6～8周齡），體質(zhì)量250～300 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（浙）2015-001。

1.1.2 儀器：腦立體定位儀購于德國KOPF公司；微透析系統(tǒng)包括CMA402型微透析泵、CMA/12型微透析探針（透析膜長度2.0 mm，直徑0.5 mm）、探針引導(dǎo)管、CMA120型清醒動物活動裝置均購于瑞典CMA/Microdialysis公司。Agilent1100型高效液相色譜儀和Aglient C18色譜柱（2.1 mm i.d.×150 mm，5 μm）均購于美國Aglient公司；Decade II SDC電化學分析儀購于荷蘭Antec Leyden公司；低溫離心機購于美國Thermo Fisher公司；XEVO TQ-S micro質(zhì)譜儀購于美國Waters公司。

1.1.3 試劑：6-羥基多巴胺（6-OHDA）、腎上腺素（epinephrine，E）、NE、DA、3，4-二羥基苯乙酸（3，4-Dihydroxyphenylaceticacid，DOPAC）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、高香草酸（homovanillic acid，HVA）、5-HT均購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 PD大鼠造模：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉，使用耳桿將其頭部水平固定于立體定位儀上，頭部剃毛消毒，在頭部做縱向切口，暴露前囟和人字點。參考《大鼠腦立體定位圖譜》，選取右側(cè)紋狀體作為注射區(qū)，定位坐標為前囟0.7 mm、中線右旁3.0 mm、硬膜下5.5 mm，并使用臺式牙科鉆在顱骨上鉆出注射口。微量注射器吸取1.5 μg/μL的6-OHDA溶液10 μL（由含有2.0 g/L維生素C的0.9%氯化鈉溶液配制），并使用微量注射泵以10 nL/s的速度進行緩慢注射，且為了使藥物充分彌散，每注射5 μL間隔留針5 min，注射完畢后也留針10 min，最后緩慢勻速退出注射器，縫合處理傷口，待其清醒后回籠正常飼養(yǎng)。

1.2.2 分組：手術(shù)后1周，對造模大鼠進行行為學檢測，連續(xù)4周，每周1次，每次腹腔注射阿撲嗎啡溶液（0.5 mg/kg）誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)行為。取動物置于干凈的盆地，觀察大鼠行為，并記錄每分鐘大鼠向未損傷一側(cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)以及0.5 h內(nèi)旋轉(zhuǎn)的總次數(shù)。旋轉(zhuǎn)360°記為1圈/轉(zhuǎn)（r），普遍認為30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)穩(wěn)定≥7 r/min時，判定該帕金森大鼠模型建立成功[4]。將造模成功的大鼠隨機分為PD組，PD+L6H3組，每組10只。PD+L6H3組連續(xù)2周給予L6H3（腹腔注射，50 mg/kg）。另作15只假手術(shù)組大鼠，按上述同樣坐標和操作方法，注射等體積含有2.0 g/L維生素C的0.9%氯化鈉溶液。定期觀察記錄大鼠狀態(tài)，并按時補充飼料和水分。

1.2.3 色譜條件：色譜柱Aglient C18柱（2.1 mm i.d.×150 mm，5 μm）；流動相為pH=3.0的0.1 mol/L H3PO4-NaH2PO4緩沖液與甲醇的混合液（90:10，V/V；緩沖液中含2.0 mmol/L KCl、0.1 mmol/L Na2EDTA和0.74 mmol/L辛烷磺酸鈉），流速為0.3 mL/min，柱溫恒定37 ℃。電化學檢測為三電極系統(tǒng)：以玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，并以不銹鋼基體為輔助電極。工作電位為0.55 V，進樣量為20 μL。

1.2.4 微透析活體取樣：在造模后的第4周后開始給藥，L6H3給藥后第1、2周（即造模后第5、6周）和停藥后第1周（即造模后第7周），用給藥時已埋入的引導(dǎo)管分別對假手術(shù)組、PD組和PD+L6H3組（每組10只）進行腦部紋狀體組織活體微透析取得細胞外液。取樣時在大鼠輕度麻醉后將探針緩慢地插入引導(dǎo)管定位的紋狀體區(qū)，而在大鼠清醒自由活動狀態(tài)下，使用Ringer試劑為灌流液，以1.0 L/min的微透析速率收集樣品。為了避免之前外科手術(shù)帶來的損傷，前60 min的樣品將會被棄去，收集的樣品被置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 LC-MS/MS檢測鼠大腦皮質(zhì)中L6H3的含量：L6H3給藥24 h后，取鼠大腦皮質(zhì)，稱重后置于1.5 mL的EP管中，按比例加入裂解液后勻漿，離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取100 μL上清液轉(zhuǎn)移至新EP管中，加入200 μL乙腈，渦旋1 min，再離心10 min（13 000 r/min，4 ℃），取上清液至內(nèi)襯管中，放入進樣瓶中進行LC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦內(nèi)L6H3含量的檢測 給藥后在鼠大腦皮層中能夠檢測到L6H3的存在，表明L6H3能透過大鼠的血腦屏障，見圖1。

圖1 L6H3的結(jié)構(gòu)示意圖及LC-MS/MS檢測L6H3的色譜圖

2.2 PD組大鼠腦部損傷側(cè)紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)檢測 PD組大鼠腦部紋狀體細胞外液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的色譜分離圖，各物質(zhì)在30 min內(nèi)能完全分離出來，見圖2。

圖2 PD組大鼠腦紋狀體微透析液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的色譜分離圖

2.3 3組大鼠腦部紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測 與假手術(shù)組相比，PD組腦部損傷側(cè)紋狀體細胞外液中的DA、DOPAC、HVA、NE、E、5-HT和5-HIAA含量在造模4周后均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與PD組相比，PD+L6H3組的DA、NE和E含量于造模第6周（給藥第2周）和造模第7周（停藥第1周）后明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與PD組相比，PD+L6H3組的DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA的含量于造模第6周（給藥第2周）和造模第7周（停藥第1周）顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 造模后第4周、第5、第6周（給藥后第1、第2周）及第7周（停藥后第1 周）3 組大鼠紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化

3 討論

PD手術(shù)治療費用昂貴，目前還是以藥物治療為主。如臨床上較常使用的左旋多巴，只能通過外源性補充腦內(nèi)DA，緩解PD癥狀，但其不能改善DA能神經(jīng)元變性，對疾病的進程沒有治療作用。近年來，PD藥物治療由直接補充DA轉(zhuǎn)向多環(huán)節(jié)治療，重點集中于對DA能神經(jīng)元的保護作用。

姜黃素是一種從姜科植物的根莖中提取的具有α，β-不飽和二酮的化合物[2]。該天然產(chǎn)物表現(xiàn)出降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護DA能神經(jīng)元等功能[5]，但姜黃素也具有穩(wěn)定性差、生物利用度低、不能通過血腦屏障等不能成藥的缺點[6]。L6H3是去除姜黃素結(jié)構(gòu)中不穩(wěn)定的β-二酮基團，同時保留了姜黃素的有效治療基團的姜黃素類似物。L6H3能順利通過血腦屏障，具有不受給藥途徑限制的優(yōu)點。本研究表明，L6H3能提高PD大鼠腦紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，顯示其可能具有DA能神經(jīng)元保護作用，具體的作用機制有待進一步研究。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是調(diào)控機體生物活動的重要物質(zhì)，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮信息傳遞的物質(zhì)。目前研究認為，PD病理表現(xiàn)的DA能神經(jīng)元變性、死亡，導(dǎo)致腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)失衡，其中在黑質(zhì)-紋狀體通路以DA為代表的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化最為顯著。NE是由腦內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)末梢合成及分泌的神經(jīng)遞質(zhì)，PD患者血清中NE的含量較低[7]。5-HT作為神經(jīng)遞質(zhì)參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能調(diào)節(jié)。有研究顯示[8]，PD患者腦中5-HT出現(xiàn)輕到中度的降低，而持續(xù)性的5-HT降低可增加PD患者抑郁癥狀的發(fā)生。目前已有大量研究通過檢測紋狀體區(qū)域的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)作為PD的病理生理狀態(tài)的評估[9]。

測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)常用的方法有熒光法、放射酶學法、毛細血管電泳法和高效液相色譜法等。熒光法存在樣品前處理復(fù)雜、結(jié)果重復(fù)性差等缺點。放射酶學法有較高的靈敏度，而操作條件嚴苛、技術(shù)難度高以及檢測速度慢等缺點限制其使用與推廣；色譜法具有分離效率高、選擇性好的特點；電化學檢測器具有靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點。較HPLC-UV和HPLC-熒光，HPLC-ECD聯(lián)用后靈敏度更高、檢出值更低，更適用于檢測腦組織中微量的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量[10]。目前HPLC-ECD已被廣泛應(yīng)用于檢測實驗動物腦中以及臨床患者腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)的含量，并且能夠同時檢測多種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。

由于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在腦中的含量極少，且對光、熱均不穩(wěn)定，有效的樣品處理方法同樣是測定腦中神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)鍵。而當前大多檢測動物實驗樣品均是從已死亡的腦組織中提取的組織液，如液氮凍斃后的蜜蜂腦組織勻漿液[9]、大鼠腦組織勻漿液[11]、家兔腦組織勻漿液。動物的麻醉狀態(tài)及后期樣品的收集過程，都會對組織液中神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生變化，因而其結(jié)果并不能真實地反映神經(jīng)遞質(zhì)的變化。微透析活體取樣為一種新型生物采樣技術(shù)，它是通過將一個尖端帶有可透過小分子物質(zhì)的半透膜探針插入活體動物組織進行生物采樣，能夠在不影響動物正常生理活動的情況下收集生理活性樣品，幫助動態(tài)研究生物體的某些生化物質(zhì)的變化[12]。該方法收集的樣品已直接排除蛋白質(zhì)等大分子的干擾，具有處理操作快速簡單的優(yōu)點[13-14]，能在最大程度上保留樣品中神經(jīng)遞質(zhì)含量。也有研究報道測量血漿[15]、尿液[16]中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，但這只是通過檢測神經(jīng)遞質(zhì)代謝后的含量來間接反映神經(jīng)遞質(zhì)釋放情況；而紋狀體微透析液中的細胞外神經(jīng)遞質(zhì)主要來自于神經(jīng)末梢的釋放，因此紋狀體細胞外液能夠直接反映神經(jīng)遞質(zhì)的釋放情況。將微透析活體取樣與HPLC-ECD相結(jié)合具有靈敏度高、分離有效和所需樣品量小等特點。本研究采用微滲透活體取樣與HPLC-ECD聯(lián)用檢測大鼠腦部紋狀體細胞外液中7種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物，結(jié)果顯示，6-OHDA造模后腦部紋狀體細胞外液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的含量顯著降低，再次驗證了PD腦紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量降低。給予L6H3 2周后，L6H3能使單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的含量升高。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化是遞質(zhì)代謝疾病PD研究治療藥物的指標。更值得注意的是，在L6H3停藥1周后單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的含量沒有因為停藥而降低，而是保持增加趨勢，說明L6H3的治療作用可能不是單純的通過給藥時上調(diào)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，可能是通過發(fā)揮其DA能神經(jīng)元的修復(fù)作用，其主要作用機制也值得進一步深入研究。